В V(D)J-рекомбинации участвуют два когезина с взаимодополняющими функциями

Формирование огромного разнообразия антител и Т-клеточных рецепторов (TCR) в организме позвоночных происходит за счет V(D)J-рекомбинации — комбинирования повторяющихся сегментов, из которых состоят гены иммуноглобулинов, в созревающих B- и T-лимфоцитах. Авторы статьи в Nature Communications обнаружили, что в этом процессе участвуют белки когезинового комплекса STAG1 и STAG2, причем они играют разные роли. STAG1 способствует взаимодействию между далекими друг от друга сегментами ДНК, а STAG2 предотвращает раннее образование слишком больших петель.

Важную роль в V(D)J-рекомбинации в развивающихся B-клетках играет экструзия петель, опосредованная когезином. Она обеспечивает доступность хроматина для эндонуклеазы RAG, которая инициирует рекомбинацию экзонов D и J (DJ-рекомбинация), а затем V и DJ (VDJ-рекомбинация). Ученые проанализировали вклад двух субъединиц когезина, STAG1 и STAG2, в культуре про-B-клеток, трансформированных вирусом мышиного лейкоза Абельсона (v-Abl). Эта клеточная линия содержит аллели тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH), рекомбинацию которых и отслеживали в экспериментах. 

Ученые провели нокаут Stag1 и Stag2 с помощью CRISPR-Cas9 в иммортализованной про-B-клеточной линии с мутацией в RAG1, нарушающей ее каталитическую функцию. В этих клетках можно индуцировать V(D)J-рекомбинацию, восстановив экспрессию RAG1 дикого типа и индуцировав переход в фазу G1. Как и ожидалось, при наличии Stag1 и Stag2 в клетках наблюдалась активная DJ- и ограниченная VDJ-рекомбинация, которая затрагивала в основном шесть ближайших сегментов V_H; похожая картина сохранялась при нокауте Stag1. А вот нокаут Stag2 приводил к усилению VDJ-рекомбинации по всему локусу, причем в первую очередь на дальних расстояниях, а не между ближайшими сегментами. 

Затем авторы проверили, как нокаут STAG1 и STAG2 влияет на формирование петель в локусе IgH, с помощью фиксации конформации хромосом (3C). Как и профиль рекомбинации, картина в Stag1^-/- клетках была аналогичной тому, что наблюдалось в диком типе. Но в Stag2^-/- клетках сегменты VH, находящиеся на средних и дальних расстояниях, значительно чаще обнаруживались в центрах рекомбинации. 

Исследователи измерили уровни STAG1 и STAG2 при помощи вестерн-блоттинга. Оказалось, что при нокауте Stag2 количество белка STAG1 возрастало вдвое, но не наоборот (при нокауте Stag1 уровень его паралога практически не менялся). Авторы предполагают, что экспрессия STAG1 обычно подавляется STAG2, и утрата STAG2 активирует STAG1-когезиновые комплексы, которые формируют удлиненные петли IgH.

В этапе VHDJH-рекомбинации участвует WAPL — белок, снимающий когезиновые комплексы с петель ДНК. Дефицит WAPL приводит к тому, что когезин дольше остается на петлях ДНК, что также усиливает рекомбинацию с участием дистальных сегментов V_H. Ученые сравнили этот эффект с влиянием нокаута STAG2 и показали, что экструзия петель в первом случае усиливается еще больше, то есть способствует VHDJH-рекомбинации на дальних расстояниях. Вероятно, это обеспечивает использование более широкого спектра V_H. 

Авторы также показали, что формирование удлиненных петель требует наличия N-концевого мотива в белке CTCF, защищающего когезин от снятия с хроматина белком WAPL. 

Наконец, исследователи проверили, как нокаут Stag1 и Stag2 повлияет на VHDJH-рекомбинацию при дефиците WAPL. Они получили линии двойных мутантов — с нокаутом WAPL и одной из когезиновых субъединиц. Фенотип обеих линий оказался схожим (в обоих случаях средние и дистальные сегменты V_H участвовали в рекомбинации активнее, чем в диком типе, но меньше, чем при нокауте только WAPL). Ученые предположили, что совместная активность STAG1 и STAG2 обеспечивает полноценное формирование длинных петель ДНК в отсутствие WAPL. 

Таким образом, делеция STAG2 усиливает взаимодействие STAG1-когезина с хроматином, что приводит к раннему образованию длинных петель и обеспечивает использование дистальных сегментов в V(D)J-рекомбинации. В клетках с дефицитом белка WAPL, снимающего когезин с хроматина (они соответствуют стадии рекомбинации VDJ), оба варианта когезина действуют совместно, формируя репертуар VH. Авторы приходят к выводу, что STAG1 и STAG2 играют в формировании разнообразия антител взаимодополняющую роль. 

Из консервативных участков вирусных белков можно сконструировать вакцину против целого семейства вирусов