Ферменты стрептомицетов помогли снизить токсичность противогрибковых препаратов

Основными средствами борьбы с грибковыми инфекциями остаются полиеновые препараты, такие как амфотерицин B (AmB) или нистатин A1 (NysA1). Полиены — это сложные поликетидные природные соединения с широким спектром противогрибковой активности, и резистентность к ним развивается редко. Однако они токсичны также для клеток человека и могут вызывать серьезные побочные эффекты, а их растворимость ограничена. Авторы статьи в Nature проанализировали гены их биосинтеза и описали способы получения новых полиенов с помощью ферментативного синтеза.

Известно, что ключевую роль в регуляции как активности, так и растворимости полиенов играет гликозилирование. Изначально ученые проанализировали гликозилтрансферазу, которая присоединяет второй остаток сахара — 4-O-метил-L-дигитоксозу — к сельвамицину, противогрибковому средству с низкой активностью. Они предположили, что с помощью этого же фермента можно получить производные амфотерицина или нистатина с улучшенными свойствами. 

Кластер генов синтеза сельвамицина содержит субкластер тимидилдифосфат-L-дигитоксозы (TDP-L-дигитоксозы) и предполагаемую гликозилтрансферазу SelSV. Функцию этого фермента авторы определили экспериментально — его оверэкспрессировали в клетках кишечной палочки, а затем оценили активность, используя TDP-D-глюкозу вместе с AmB или NysA1 вместо нативных субстратов. Однако при такой замене синтез практически не происходил. Тогда ученые провели поиск гомологов SelSV, чтобы найти ферменты, способные катализировать нужную реакцию. 

Биоинформатический анализ выявил предполагаемые гликозилтрансферазы nysSV в геномах стрептомицетов Streptomyces noursei и S. albulus. Оба вида продуцируют нистатин А1 и родственный ему нистатин А3. Степень сходства последовательностей составила 98%, и в обоих случаях они обнаружились в составе кластера генов биосинтеза TDP-L-дигитоксозы. Также были выявлены гены mycS3 из S. netropsis и kfuSV из S. kasugaensis, расположенные в кластерах биосинтеза полиенов. 

Для проверки функции nysSV из S. noursei и S. albulus авторы инкубировали нистатин А3 и TDP с каждым из этих ферментов — это привело к удалению L-дигитоксозы из молекулы и образованию нистатина А1. С учетом обратимости этой реакции ученые приходят к выводу, что оба nysSV участвуют в синтезе нистатина А3. 
Также ученые экспериментально подтвердили роль mycS3. S. netropsis, в геноме которого обнаружился этот ген, синтезирует микогептин — полиен, структурно родственный амфотерицину B. MycS3, как выяснилось, гликозилирует его производное, дигидромикогептин.

Выявленный авторами kfuSV участвует в биосинтезе касуфунгина, и это первое свидетельство того, что S. kasugaensis способен синтезировать полиены. Проанализировав биосинтетический кластер и определив структуры пяти полиенов, ученые обозначили их как касуфунгины A–E и предложили путь биосинтеза. По их данным, касуфунгин А является конечным продуктом этого пути, так как он наиболее функционализирован, а касуфунгин В встречается чаще всего и обладает уникальной структурой (как самого макроциклического кольца, так и остатков сахара).

Наконец, ученые получили производное амфотерицина B — AmB-L-дигитоксозу — и проверили его активность в отношении десяти клинически значимых грибковых патогенов. Также они протестировали NysA3 и его производные. Нистатин A3 оказался эффективнее, чем его предшественник нистатин А1, против шести из десяти патогенов, и авторы задались целью снизить его токсичность для клеток млекопитающих. 

Вместо дорогостоящих химических модификаций, которые применялись для снижения токсичности амфотерицина B, ученые использовали ферментативный катализ. Они получили несколько амидных производных по положению C16 и дополнили некоторые из них второй функциональной группой. Например, Nys34 был также модифицирован серинолом; он и другие варианты нистатина с двойной функционализацией менее выраженно вызывали гемолиз, чем исходный нистатин A3. Однако Nys34 оказался наиболее перспективным. 

Nys34 протестировали на клеточных линиях человека — HEK293, A549 (клетки легких) и гепатоцитах HepG2. Он был в 3–8 раз менее токсичен, чем амфотерицин B, и хорошо переносился мышами. Признаки токсичности развивались только после четвертого введения дозы 10 мг/кг внутрибрюшинно (для сравнения, NysA1 вызывает острую токсичность уже при введении 4,4 мг/кг). При дозировке в 5 мг/кг все четыре дозы переносились хорошо. 

Что важно, такой режим был эффективен против грибковой инфекции. В мышиной модели инвазивного аспергиллеза четыре дозы Nys34 снизили количество Aspergillus fumigatus в легких на 87%. Для сравнения, лечение амфотерицином B сокращало патогенную нагрузку только на 35%. 

Таким образом, производные противогрибкового полиена нистатина, полученные с помощью ферментативного синтеза, отличаются улучшенными свойствами по сравнению с препаратами, которые сейчас применяются в клинической практике. Это делает их перспективными для дальнейшего клинического развития.

Мандимицин — новое природное соединение, эффективное против резистентных грибков