Как мы построили производство ПЦР-наборов «Амплисенс»

Перестройка и ПЦР 
Дифтерийный корпус 
Дифтерия, менингококк и туберкулез 
Лондон — Москва: расшифровка кишечных инфекций 
Несколько метров нуклеотидной последовательности 
Тест на ВИЧ 
Четыре комнаты 
«Амплисенс» 
«Здесь будет производство!» 
Выигрыш у Abbott,«Джин» и «Аладдин» 
Новый этап

Перестройка и ПЦР

Герман Александрович, как ваш путь в науке привел вас к молекулярной диагностике?

Это был 1987 год, я, будучи студентом третьего курса медико-биологического факультета Второго меда, по приглашению своего бывшего однокурсника Игоря Чивилева пришел в лабораторию Светланы Андреевны Лимборской в Институте молекулярной генетики РАН и там делал дипломную работу. Знаете, всегда поднимают тост за учителей, и мне повезло с учителями. Прекрасные люди были — мой непосредственный начальник, микрошеф, Сергей Корнеев, сейчас в Англии работает, и маленькая группа нейробиологии в лаборатории молекулярной генетики, к которой я был пристроен. У нас была достаточно интересная работа, объектом исследования была виноградная улитка.

Вы работали с гигантскими нейронами виноградной улитки?

Да. И моим коллаборатором был Дмитрий Антонович Сахаров, известный нейробиолог, у него были свои оригинальные взгляды, и вообще он был очень интересный человек, поэт. Он разработал модель, в которой обучал этих улиток, а их поведением управляют гигантские нейроны, размером около миллиметра. Нашей задачей было разработать метод, который позволит посмотреть, что происходит при разных формах поведения на уровне экспрессии генов. Сейчас такие задачи решаются гораздо проще, а тогда не было нормальных инструментов. Секвенирование по Сэнгеру делали с помощью гелей и нуклеотидов с радиоактивной меткой. И прочесть больше 200 нуклеотидов не удавалось, это такое мучение было. А чтобы сравнить экспрессию генов улиток, которые были подвергнуты разным воздействиям, нужно было делать кДНК-библиотеки из этих нейронов, потом их вычитание. Методы, которые мы использовали, на тот момент были передовыми.

Но случился 1991 год, и, наверное, треть сотрудников уехали за рубеж, Сергей Корнеев тоже уехал. Я остался один на один с этой действительностью. Дипломную работу защитил на отлично, и кое-что интересное в нейробиологии мы обнаружили, я был горд этим своим микрооткрытием.

В 1991 году я поступил в аспирантуру, у меня стипендия была 1000 рублей, а пакет молока стоил сто рублей. Я понял, что не проживу на эти деньги, и, к сожалению, из аспирантуры пришлось уйти. Меня пригласили в ЦНИИ эпидемиологии, директором его был Валентин Иванович Покровский, в то время президент Академии медицинских наук. Ему было тогда столько, сколько мне сейчас, я с ним 27 лет проработал, до 2018 года. Валентин Иванович мне предложил войти в группу, которая должна была заниматься разработкой тестов на инфекционные заболевания на основе ПЦР.

То есть это было его идея?

Нужно отдать должное руководству ЦНИИ эпидемиологии в лице Валентина Ивановича, это действительно был такой инсайт, понимание, что за этим будущее. С тех пор, как появился ПЦР, на тот момент меньше десяти лет прошло. Хотя я уже с 1987 года в своей дипломной работе ее использовал, и тогда уже были созданы ферменты, и даже первые амплификаторы появились. У нас амплификаторов не было, я поначалу делал ПЦР вручную, сам работал амплификатором. Берется плотик из поролона, в отверстия в нем вставляются пробирки, и плотик ставится в водяные бани на три температуры — на 95 градусов, потом на 60, 70 градусов, и так сорок раз.

Может быть, Валентину Ивановичу это кто-то посоветовал, но, скорее всего, это была его догадка, что эти новые методы нужно активно внедрять в эпидемиологию. Так что была создана группа разработчиков, около десятка человек. Не было помещений, и нас разместили во Второй инфекционной больнице на Соколиной горе, дали три комнаты в бывшем радиационном блоке дифтерийного корпуса. Там было по одной розетке в каждой комнате, не было оборудования, даже столов, потом как-то мы обустроились, дали нам один старый ламинар. И первое, что мы сделали, — это провели семинар, первый семинар по ПЦР, по молекулярной диагностике. Туда пригласили и заинтересованные компании, и клиентов, семинар достаточно активно прошел. Так это все начиналось.

А в мире? Была уже молекулярная диагностика, были тесты?

Нет, конечно, нет. Девяносто первый год — это самое начало. Публикаций очень много в то время было. А компании? Там была такая история: Кэри Муллис, после того как изобрел ПЦР, долгое время не мог ее коммерциализировать. В конце концов патент на использование ПЦР в лабораторной диагностике в 1991 году был продан компании Roche за 300 миллионов долларов. Я уже начал следить за тем, что происходит в мире. Тогда не было интернета, я пошел в медицинскую библиотеку на Профсоюзной, взял Science и увидел новость о том, что Roche купила патент. И когда я стал смотреть, входит ли Российская Федерация в зону поддержания патента, то, к своей радости, обнаружил, что Roche не будет поддерживать патент на территории России, видимо, потому что была разруха, и они сочли неактуальным защищать свое право здесь. Это означало, что в принципе российские ученые могли на тот момент спокойно коммерциализировать тесты, и это было очень важно. Можно сказать, это была ошибка гиганта, потому что, хотя у нас в то время экономика была не очень, но молекулярно-биологическая школа Советского Союза была одной из самых сильных.

Они ее недооценили.

Недооценили, да. И сейчас ПЦР — это, наверное, единственный рынок в области лабораторной диагностики, который на 80–90% занят российскими производителями. Такие компании, как Abbott, Roche и другие, конечно, присутствуют, и китайские компании, но существенно уступают нашим компаниям и институтам. Я помню, что испытал такое, знаете, крещендо в душе, момент истины — вот теперь можно спокойно это все разрабатывать, стратегически у нас это получится, рынок в России свободен для создания этих тестов.

Дифтерийный корпус

С 1991 года по 1993-й наша лаборатория, которую мы таковой считали, это, конечно, не лаборатория была. Столы мы купили, а все полки и так далее я сделал своими руками — у меня была пила, я жил в общежитии. ПЦР-боксов у нас не было. Я на помойке Второй инфекционной нашел деревянные навесные полки, мы их помыли, простерилизовали, повесили внутрь УФ-лампы и заклеили клеенкой. Так что у нас первые ПЦР-боксы были в буквальном смысле деревянные.

А амплификаторы были?

С амплификаторами было самое сложное. Финансовая ситуация была в то время такая, что мы все работали на четверть ставки, и денег на оборудование не было, мы не могли их себе позволить.

А как работать?

Тогда с нами сотрудничала компания «Биоком», Комаров Андрей ей руководил, и они поставили нам оборудование бесплатно, потому что были заинтересованы, чтобы тесты разрабатывались, хотели с нами сотрудничать. Это были приборы не для ПЦР в реальном времени, конечно, а обычные амплификаторы с детекцией по конечной точке с помощью фореза.

Таким образом мы смогли лабораторию оснастить, но работать было непросто: помещение неприспособленное, ламинары старые, ПЦР-боксы деревянные, два амплификатора, которые нам дала в пользование компания. Коллектив был маленький: 10–14 человек, которых Валентин Иванович собрал в начале, недолго просуществовал. Целая делегация наших людей поехала в Иран, иранцы тоже хотели с нами сотрудничать. В 1993 году мы все улетели в Иран, там в Институте Пастера тренинги проводили, работали. Когда здесь был штурм Белого дома, мы смотрели эти события из Ирана. Потом я вернулся на свое рабочее место, но часть сотрудников осталась в Иране, часть уволилась. Осталось несколько человек — я, Ольга Юрьевна Шипулина, Безруков Владислав Михайлович и Чуланов Владимир Петрович, тогда он был студентом Первого меда. И мы приступили к этим разработкам.

Мне тогда было 27 лет. А вокруг вся эта атмосфера, постперестроечная Россия, Гайдар, Ельцин, штурм Белого дома. Но мы как-то об этом не думали. Наверное, это свойство молодости, что она думает о будущем, а не о настоящем и не о прошлом. И нам очень хотелось что-то сделать.

Хотя я честно скажу, когда мне Валентин Иванович предложил перейти в ЦНИИ эпидемиологии и заниматься разработкой тестов на основе ПЦР, мне показалось, что это не очень интересно. В лаборатории Лимборской ПЦР стала уже рутинной методикой, ее студенты второго-третьего курса осваивали, мы гораздо более сложные вещи делали. Ну, выбрать праймеры, сделать ПЦР-смесь, раскапать, поставить в амплификатор — это все казалось банальным. И я даже немножко, знаете, расстроился, обиделся на судьбу. А потом стало интересно, потому что оказалось, что выбрать праймеры и провести ПЦР-анализ — это пять процентов успеха. Метод лабораторной диагностики включает в себя все — от забора материала до выдачи результатов, и там уже много новых знаний появляется. И самое главное, что, в отличие от фундаментальной науки, ты сразу видишь результат своей работы.

В чем суть прикладной науки? Когда ты дрова рубишь, то сразу видишь результат. И получаешь такое короткое удовольствие, как мороженое съесть. А если ты начнешь читать «Братьев Карамазовых», то потребуются значительные усилия и время, затраченное на чтение и понимание написанного, и возможно, по окончании чтения ты получишь удовольствие. Так же с фундаментальной наукой: для того, чтобы получить удовольствие от результата, приходится заниматься долгой, рутинной работой — сутками сидишь в лаборатории. Чтобы методики наладить, ты должен много работать руками. Мне говорили, что наиболее продуктивные наши молекулярные биологи домой не ходили по несколько дней, буквально спали на работе. Поставил гибридизацию, поспал прямо за столом, поставил ПЦР, побежал, ребенка из садика забрал, отвел его в гости, прибежал, и снова за работу. И так круглосуточно. А результаты потом бывают не всегда однозначными или даже разочаровывающими.

Но в случае с ПЦР в диагностике инфекций метод прямой детекции патогенов оказался настолько простым и эффективным, что сравнительно небольшие усилия по его разработке давали абсолютно новые фундаментальные знания в области инфекционных болезней и эпидемиологии. Дальше я расскажу об этом подробнее.

 

Дифтерия, менингококк и туберкулез

С чего вы начали? Как выбирали задачу?

Когда я пришел в ЦНИИ эпидемиологии, в нашей стране и в странах бывшего СССР была крупнейшая в мире вспышка дифтерии. Она началась в 1990 году, а 31 августа 1993 года число заболевших достигло 13 тысяч, в 1995 году в России заболело 75 тысяч, а в странах бывшего СССР — 157 тысяч. Вспышка произошла потому, что изменилась политика вакцинации, резко снизили охват вакцинацией. Не учли того, что вакцина работает в отношении токсина, а не в отношении микроба. Микроб просто выключает ген токсина и прячется таким образом от иммунного ответа, вызванного вакциной. Фактически, несмотря на то, что вакцинированные люди не болели, микроорганизм продолжал циркулировать, только с мутантным геном токсина. Как только убрали вакцинацию, ген мутировал обратно, токсин появился, возникла вспышка уже токсигенных штаммов. И одна из задач, которую Валентин Иванович поставил, — это разработка теста на дифтерию.

Это был ваш первый тест?

Да, первый тест, который мы разработали, это был 1993 год. Нам повезло, потому что при этом мы сделали такое микрооткрытие, с этим переключением генов. Выяснилось, что в мире микроорганизмов методами молекулярной диагностики можно обнаружить много интересного и в фундаментальном плане.

Когда мы пришли в ГИСК имени Тарасевича — Институт стандартизации и контроля, в то время полномочная организация по регистрации тестов, — заведующей лабораторией там была Татьяна Семеновна Шобухова. Она брала штаммы из коллекции и колола их в уши кроликам. Это тест на токсигенность, там некроз должен возникать. И что же мы видим? Мы видим, что те штаммы, которые она закалывает в уши кроликам, не вызывают поражения, а мы по ПЦР эти штаммы идентифицируем как токсигенные, представляете? Она говорит: у вас плохая методика, она дает ложноположительные результаты. Потом выяснилось, что мы столкнулись с феноменом, который как раз объясняет, почему возникла вспышка. Феномен очень простой, но он на тот момент был непонятен без использования молекулярного теста. В микроорганизме под действием вакцины ген токсина уходит в молчащее состояние, а как только вакцинация отменяется, тут же появляется токсигенный штамм.

Мы первые это обнаружили, первая публикация наша была. В МНИИЭМ имени Габричевского был референс-центр по дифтерии, им руководила Изабелла Константиновна Мазурова. Когда мы ей про это рассказали, вся их группа за это схватилась, они поехали в CDC, Центры по контролю и профилактике заболеваний США, и опубликовали международное исследование. На мой взгляд, там есть еще над чем поработать, просто руки не доходят, так как дифтерии сейчас мало, потому что от нее продолжают вакцинировать.

Второе, что мы начали разрабатывать, — это туберкулез, и до сих пор молекулярная диагностика туберкулеза — тема номер один. Я и сейчас ею активно занимаюсь, нельзя сказать, что сейчас у нас на рынке существуют совершенные тесты. А тогда была середина девяностых. Мы эти тесты начали разрабатывать не для людей, а для животных. У нас был интересант в лице ВГНКИ — это контрольный институт, Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов.

Почему для животных, а не для людей?

Поймите, в то время в молекулярную диагностику мало кто верил. Валентин Иванович сказал: «Сделайте тест на дифтерию» — мы сделали и зарегистрировали первый тест на дифтерию. Но по туберкулезу у человека интересантов не было в тот момент. Вообще, отношение классических наших инфекционистов и эпидемиологов к методам молекулярной диагностики было неоднозначным. Даже Вадим Валентинович Покровский, мой непосредственный начальник… А я не сказал, что когда я пришел в ЦНИИ эпидемиологии, меня оформили старшим лаборантом Центра по борьбе со СПИДом, которым он руководил. Так вот, даже он не верил, что ПЦР для тестирования может использоваться широко.

Дело в том, что когда ПЦР только появилась, люди, которые ставили ПЦР, столкнулись с большой проблемой — контаминацией, об этом упоминал даже Кэри Муллис. В процессе полимеразной цепной реакции накапливается огромное количество продуктов амплификации, копий амплифицированного участка ДНК. Достаточно открыть пробирку — все эти миллиарды молекул разлетаются на стол, на одежду исследователя. И если они попадут в другую пробирку — это идеальная матрица для последующей амплификации. Например, если ты работаешь с образцом пациента, у которого нет ВИЧ, а у тебя в его пробирку попал ампликон, то отрицательный пациент будет ложноположительным. Это было очень опасно. Кэри Муллис пишет, что когда они начали работать, то сначала не поняли, что произошло: буквально через несколько дней вся лаборатория была контаминирована, и они переехали в другую. А еще через несколько дней контаминировали следующую. И они стали придумывать способы борьбы и правильную организацию лаборатории.

Мы тоже с этим столкнулись. Когда мы в этих трех комнатах начали работать, мы тут же загадили всю нашу научно-исследовательскую лабораторию продуктами амплификации. Отмывали это все несколько дней и не могли отмыть, потому что очень сложно уничтожить ампликоны. А потом мы поняли, что нельзя в одной и той же комнате и ставить ПЦР, и проводить работу с ампликонами, в том случае это был электрофорез. Пришлось вынести электрофорез из дифтерийного корпуса в четвертый корпус Второй инфекционной больницы, в лабораторию Александра Евгеньевича Платонова, где-то за 500 метров. И вот, каждый день несколько раз туда-сюда ходишь — здесь ПЦР, там форез. Там отвели для нас одну маленькую комнатку, и мы переодевались, когда входили в эту комнатку. Вот так мы от контаминации спаслись.

И разработали тест для туберкулеза?

Да, мы разработали тест, и в то время, наверное, в 1995 году, уже начали появляться первые отечественные компании. По-моему, уже был «Литех», созданный в Институте физико-химической медицины. Это один из пионеров, они до сих пор существуют на рынке. Была такая компания «ВСМ» (Внедрение систем в медицину). И первые амплификаторы появились, как я говорил, в компании «Биоком», достаточно быстро их разработали наши электронщики. Были и другие компании, в Москве, в Туле — три-четыре компании создали амплификаторы, то есть, уже появился некий рынок приборов. И, в общем, с 1991 года, когда я начал этим заниматься, по 1995-й практически вся инфраструктура была создана. Все необходимое было — и ламинары, и ПЦР-боксы, импортные и отечественные.

И, опять же, повезло, потому что Александр Евгеньевич Платонов, у которого мы ставили форезы, был увлеченным специалистом в области менингококковой инфекции. Во Вторую инфекционную больницу со всей Москвы свозили пациентов с гнойными менингитами. Так вот, Александр Евгеньевич Платонов — человек необычной судьбы, физик по образованию, занимался сперва иммунологией, а затем Валентин Иванович ему поручил менингококковую инфекцию, и он сделал докторскую, изучал очень интересный феномен.

Загадка менингококковой инфекции в том, что она очень распространена, но болеют не все. Допустим, вы и я инфицированы, я могу заболеть, а вы нет. Это загадка, на которую до сих пор нет отгадки. Неизвестно, какие гены вовлечены в предрасположенность к большинству инфекционных болезней. Такой же феномен описан, например, для туберкулеза. Возбудитель распространен во всей популяции, но болеют единицы. Пять-десять процентов инфицированных заболевают в течение года, остальные не болеют и доживают до старости без проявления болезни. Тут очень сложное взаимодействие между микроорганизмом и клетками человека — на уровне экспрессии генов, на уровне трансляции, белков, посттрансляционной модификации, цитокинов, это целая наука.

Александр Евгеньевич привлек меня к этим исследованиям. Он как раз в это время делал свою докторскую по генетике предрасположенности к менингококковой инфекции. А это было начало 1990-х, тогда и методов соответствующих еще не было. Мы это делали с помощью ПЦР. И одна из гипотез была в том, что отдельные компоненты иммунной системы вовлечены в предрасположенность к менингококковой инфекции. Мы взяли С8 компонент комплемента, я разработал тест для выявления мутации, при которой С8 отсутствует в крови. И далее мы начали искать пациентов, а это очень редкие случаи — когда С8 нет, пациенты часто заболевают разными инфекциями. Мы таких пациентов нашли, построили регистр, это была интересная работа. Мы пошли не от инфекционной болезни, а от генетики.

Кстати, благодаря Александру Евгеньевичу мы выиграли несколько европейских грантов. У меня была стажировка несколько месяцев в Голландии, в Амстердамском медицинском центре, там лаборатория по менингококковой инфекции. Это мне позволило очень сильно развиться, потому что я увидел, как работать, когда любые реактивы ты можешь сразу получить, праймеры заказываешь — через два-три дня приходят. Очень продуктивно я там поработал. Вот как раз здесь я хочу рассказать, как простой метод лабораторной диагностики совершил переворот в частной эпидемиологии.

Лондон — Москва: расшифровка кишечных инфекций

Кроме вышеупомянутого гранта, которые мы получили благодаря Александру Евгеньевичу, был грант для установления рабочих отношений с учеными Великобритании. Мы попали в Управление по охране здоровья — Health Protection Agency, HPA, оно, примерно как Роспотребнадзор у нас, отвечает за защиту населения от инфекционных заболеваний и вредных факторов среды. Позже его включили в Управление общественного здравоохранения Англии, PHE. Один из центров HPA был в северо-западном Лондоне, в районе Коллиндейл. Там мы познакомились с целым рядом выдающихся заведующих лабораториями, которые занимались диагностикой и эпидемиологией инфекционных заболеваний, включая кишечные инфекции.

И вот, там я встретился с Дэвидом Брауном — известный человек был в своей области, он сейчас, наверное, уже не работает, — и обратил внимание, что на стене висят постеры о какой-то таинственной калицивирусной инфекции, которая захлестнула Лондон. Во время переговоров я спросил, что это такое. Он рассказал про калицивирусы, вызывающие кишечные заболевания у людей. Позже эти калицивирусы стали называть норовирусами.

Я очень заинтересовался: судя по тому, что я видел на постерах, этот калицивирус доминировал в структуре вспышечной заболеваемости. Попросил у них положительные образцы — кДНК, то есть искусственные, неинфекционные, — они мне дали. В Москве мы сделали праймеры и попытались идентифицировать эту калицивирусную инфекцию с помощью ПЦР.

Когда я пришел в ЦНИИ, на ученых советах говорили, что подавляющее большинство вспышечных кишечных заболеваний в стране вызывается патогеном, который явно существует, передается фекально-оральным путем, но не диагностируется. Этот феномен в шутку называли «машилиоз», по имени заведующего отделом инфекционной патологии профессора Машилова Вадима Петровича. Этиологию «машилиоза» надо было научиться определять.

Был такой профессор Боковой Александр Григорьевич из Центральной клинической больницы УДП РФ, он нам дал положительные образцы пациентов, и, о чудо, мы начали обнаруживать этот вирус! У нас в 2002 году вышла статья в «Вопросах вирусологии», до сих пор очень хорошо цитируется, под названием «Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве» — в современной терминологии она норовирусная.

По сути, с этого и началась диагностика норовирусных инфекций в Российской Федерации. Мы очень быстро сделали и зарегистрировали набор, сперва для норовируса 2 типа, потом для норовируса 1 типа. Так возникла группа кишечных инфекций. В нее входили Подколзин Александр Тихонович, сейчас он замдиректора ЦНИИ по эпидемиологии, Мухина Анна Александровна, сейчас врач аллерголог-иммунолог в ДГОИ имени Рогачева, и Абрамычева Наталья Юрьевна, теперь заведующая молекулярно-генетической лабораторией в Российском центре неврологии.

Вот этот наш первый опыт показал, как незначительные усилия — ну что там, выбрать праймер на калицивирус — могут привести к прорыву. Простая прикладная работа, разработка относительно простого теста произвела революцию в понимании структуры вспышечных заболеваний в РФ. Ведь норовирусная инфекция отвечает за огромное число вспышек кишечных инфекций, до 90% вспышек вирусных гастроэнтеритов вызываются норовирусами. И какова же была моя радость, когда в отчете главного санитарного врача РФ Геннадия Григорьевича Онищенко было констатировано, что норовирус в Российской Федерации вошел в список аннотируемых заболеваний, и эффективность расшифровки вспышек кишечных инфекций благодаря в том числе и разработанному нами тесту стала близкой к 100%.

Об этом мало кто знает, но это факт: наша поездка в Великобританию привела к тому, что доля расшифрованных острых кишечных инфекций у нас в стране выросла многократно. И этот успех сподвиг нас на то, чтобы создать группу кишечных инфекций и начать на системной основе разрабатывать наборы для других возбудителей. Норовирусы — это одна из причин, а есть еще шигелла, сальмонелла, ротавирус. Мы поставили себе цель разработать новое направление в диагностике кишечных инфекций, что закончилось созданием целой линейки тестов для детекции их основных возбудителей. Таким относительно простым способом можно приблизиться к этиологической расшифровке 100% вспышек кишечной инфекции и перейти к расшифровке спорадических случаев. В России для спорадических случаев до сих пор не достигнуты эти 100%, но тут целый ряд причин.

Очень нам помогли и коллаборации с зарубежными учеными. В 2005 году нам удалось получить международный грант совместно с CDC США. На эти деньги мы разработали практически все тесты, необходимые для детекции известных на тот момент кишечных патогенов, и провели первое многоцентровое исследование по России. Результаты опубликовали в Journal of Infectious Diseases в 2009 году, это тоже хорошая цитируемая работа. А в 2006 году мы получили грант, который спонсировался лично Тедом Тернером, создателем CNN, и благодаря этому силами группы Людмилы Карань была разработана уникальная линейка наборов для диагностики природно-очаговых и особо опасных инфекций. Эти наборы до сих пор производятся в ЦНИИ эпидемиологии и применяются во всех Центрах гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора.

Мне нравится история из так называемого потерянного интервью Стива Джобса, он потом ее несколько раз повторял. Он прочитал в журнале Scientific American в начале 1970-х годов, как исследователи измерили КПД передвижения у разных видов животных: кто сколько мышечной энергии тратит, чтобы преодолеть километр. У варана КПД низкий за счет неправильный постановки лап, а на первом месте кондор, он крыльями один раз махнет и долго летит. Человек находился где-то в последней трети списка, с вараном и бегемотом. Но когда посчитали КПД человека, который сел на велосипед, он оставил далеко позади всех животных, даже кондора.

Велосипед — относительно несложное устройство, в его основе не фундаментальная наука, а прикладная. Но оно позволяет достигать большего с меньшими усилиями. Вот ПЦР-тесты — это велосипед, который мы использовали и с его помощью вышли на исторически беспрецедентный уровень расшифровки самых частых инфекционных синдромов.

Несколько метров нуклеотидной последовательности

А в Европе в то время были тесты, подобные тем, что вы разрабатывали?

Да, Roche, которая в 1991 году купила патент на ПЦР, уже начала все это делать, и очень быстро, в 1992 году, они разработали первый качественный молекулярный тест на ВИЧ, а в 1995-м уже количественный, для определения вирусной нагрузки. А мы пока ВИЧ не занимались, Вадим Валентинович Покровский, главный специалист по ВИЧ-инфекции в России, скептически относился к тому, что мы делали. Валентин Иванович нас поддерживал, а Вадим Валентинович считал, что нас ему навязали, ну и ладно, раз отец так решил. Плюс, конечно, бедность наша, из-за которой мы не могли очень активно все это делать. Два-три года ушло только на налаживание работы. Кроме того, у нас не было баз генетических данных, только по статьям мы могли это делать.

Я помню, в начале, когда NCBI, Национальный центр биотехнологической информации в США, только зарождался, они рассылали лазерные диски. И когда они прислали первый диск в одну лабораторию Москвы, я ездил с дискетой, были тогда такие дискеты гибкие, и переписывал на нее последовательности. По-моему, в Институт молекулярной биологии ездил пару раз, потом в Институт биоорганической химии, слава богу, добрые люди бесплатно давали переписать сиквенсы. И вот я садился за компьютер — у меня одного был 386-й, который позволял засунуть в него дискету, — и нужный мне текст сиквенcа распечатывал на игольчатом принтере. Потом вырезал его ножницами и выравнивал вручную, так получались элайнменты. В какой-то момент мы даже на стенку все это повесили, то есть на стенке институтского корпуса висели элайнменты на хламидию. Это юмор такой был у нас специфический. Был один ген — когда мы склеили его сиквенс в виде строчки, он занимал несколько метров, повесили его вдоль коридора в дифтерийном корпусе.

Кстати, по поводу ветеринарии: в ВГНКИ заинтересовались тогда нашими тестами, надо отдать им должное, там были очень классные, еще советские заведующие лабораториями. И это было стимулом к тому, что мы стали разрабатывать тесты не только для медицины, но и для ветеринарии, и быстро сделали тест на туберкулез, прошли апробацию и зарегистрировали его. Потом сделали тест на бруцеллез, на Chlamydia psittaci, которая вызывает тяжелую пневмонию у людей, и еще какие-то были.

И когда после Голландии я приехал к Валентину Ивановичу в Академию медицинских наук, он говорит: вот, посмотри отчет — у нас грант был, и одна из лабораторий пыталась разработать тест на ВИЧ. А в это время Roche уже сделала свой тест. И я понял, что вот оно, удача, потому что эпидемия ВИЧ в то время уже начала стремительно нарастать, это был конец 1990-х. И все понимали, что ИФА и блот — это хорошо, но ПЦР дает совершенно другой уровень знаний о том, что происходит с вирусом. ИФА на антитела и блот на антитела — косвенные тесты, они говорят, что микроорганизм существует в организме человека, но ничего не говорят о самом микроорганизме. А ПЦР и методы секвенирования позволяют охарактеризовать сам вирус. Валентин Иванович мне дал этот отчет, и я увидел, что это не конкуренты, это просто научная лаборатория, мы на тот момент уже гораздо больше умели и понимали, как это все сделать. И я с радостью взялся за это.

Но проблема была в том, что вирусная нагрузка при ВИЧ бывает очень низкой, и нужны тесты очень высокой чувствительности, а тесты с детекцией на форезе, которые мы тогда все делали, такой чувствительности не обеспечивали. Кроме того, форез, как я сказал, контаминационно опасный. Тогда в ГИСКе был заведующий лабораторией по фамилии Блоха, он потом в Штаты эмигрировал, а эту лабораторию возглавила Волкова Рауза Асхатовна. И вот в 1995 году он ко мне приехал и говорит: понимаешь, тест работает, он дает значительный уровень информации, но его нельзя внедрять, потому что, если ты его внедряешь, то получаешь ложные результаты. Лаборанты не способны понять, что нужно обязательно отделять зону выделения ДНК, зону амплификации и зону детекции, и это надо очень подробно написать. Мы сели втроем, вместе с нашим сотрудником Владиславом Безруковым, и написали первые в России методические рекомендации по организации ПЦР-лаборатории. И после того, как были зарегистрированы тесты плюс написаны правила по организации лаборатории, уже создались условия для внедрения тестов.

Тест на ВИЧ

На самом деле, что касается ВИЧ-тестов, там две проблемы. Первая — высокая вариабельность вируса, поэтому нужно выбрать праймеры так, чтобы охватить как можно больше вариантов. И вторая, самая главная, — это требование к высокой чувствительности. Чувствительности фореза, как я сказал, не хватало, нужно было использовать либо ПЦР с вложенными праймерами, nested PCR, либо гибридизацию. Roche тогда показала путь, они сделали первый тест для детекции ВИЧ в формате гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации, сперва в качественном формате, потом в количественном. Мы, можно сказать, у них подсмотрели, что лучше не nested PCR делать, это особо опасная реакция для контаминации.

А что такое nested PCR?

Nested PCR — реакция с вложенными праймерами: ты делаешь амплификацию с одной парой праймеров, потом берешь продукт амплификации, помещаешь в пробирку, добавляешь вторые праймеры, которые лежат внутри первой пары, как в гнезде — ее по-русски называют гнездовая ПЦР. Но если ты открываешь пробирку, уже возникает риск контаминации, а если еще переносишь продукт, то он многократно возрастает. В лабораториях, которые пытались сделать nested PCR, как правило, происходила контаминация, и они потом долго не могли отмыться.

А Roche предложила использовать гибридизационно-ферментный анализ, ГиФА — это аналог ИФА, он был описан до этого, но Roche запустила его для клинического использования. И мы стали его тоже использовать, в 1996 году, наверное, первые в стране создали реакцию гибридизации на плашках. Идея была в чем? Ты делаешь амплификацию, потом переносишь ампликон в плашку, и дальше, по сути, выявляешь его с помощью иммуноферментного анализа — то есть ПЦР плюс ИФА. В то время приборами для ИФА были оснащены все лаборатории, поэтому достаточно было научить их ПЦР делать, а ИФА они и сами поставят.

Вначале мы как могли, так и работали — брали дешевые планшеты, покрывали их одноцепочечными фагмидами, обрабатывали ультрафиолетом, как-то все гибридизовалось. Мы разработали качественный тест, даже зарегистрировали и опубликовали. Тогда еще производить его негде было. Естественно, в наших трех крошечных комнатах производство было невозможно организовать. Но благодаря нашим успехам — мы начали с тестов на дифтерию и на ветеринарные инфекции — были разработаны ключевые технологии, которые потом легли в основу создания производства «Амплисенс».

А эти тесты где производились?

Не производились, мы просто получили регистрационные удостоверения. Кстати, тогда шел долгий спор о том, что такое тесты — изделия медицинского назначения или медицинские биологические препараты, ближе к вакцинам. ГИСК выступал за то, чтобы это были медицинские биологические препараты, поскольку они их регистрировали, как и вакцины и сыворотки. Потом победила группа товарищей в Минздраве, которая сказала, что это медицинские изделия, ГИСК отстранили и по другой процедуре начали регистрировать.

Вот такие достижения этого периода. Во-первых, был накоплен значительный опыт, во-вторых, разработаны первые тесты, и в-третьих, появились новые технологии и были созданы методические рекомендации, то есть некие основы для рынка были построены. Кстати, в то время мы разработали тесты не только на ВИЧ, но и на урогенитальные инфекции. Надо сказать, что все первые тесты, которые потом были поставлены на производство в ЦНИИ, были придуманы мною лично в дифтерийном корпусе.

Как вы делали выбор, какие тесты создавать?

Около 10 лет мы сидели маленькой группой в Клинической инфекционной больнице № 2. Я читал статьи и думал, в каком направлении работать. Вот я вижу статью о роли хламидий в патологии, понимаю, что это актуальный патоген, что тест нужен, и думаю, как его сделать. Там тоже все не так просто было. Даже когда ведущие компании сделали свои первые тесты, оказалось, что они дают ошибки, и потом их пришлось переделывать. И мы тоже, когда это все делали, шли по минному полю, никто не знал, какие мишени брать, какие праймеры, куда их класть, с контаминацией опять же были проблемы. Но тем не менее, когда этот период закончился, где-то 50 тестов уже было создано. И даже Вадим Валентинович поверил в то, что это может быть использовано для диагностики.

Еще с нами сотрудничал очень активный молодой врач, Василий Иосифович Шахгильдян, такой наш добрый ангел. Он был увлечен цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВ) у ВИЧ-инфицированных пациентов. И мы с 1990-х годов активно разработали для его работы тесты на ЦМВ. Но оказалось, что это вирус-оппортунист, и качественных тестов недостаточно, нужны количественные, как и на ВИЧ. И нам пришлось придумать методику, тоже на тот момент уникальную, — титрование выделенной ДНК, такая полуколичественная методика. Количественной тогда ни у кого не было, и мы первыми предложили полуколичественную с Ольгой Юрьевной Шипулиной. А затем создали первую в стране количественную методику на основе лимитирующих разведений с использованием распределения Пуассона. Сейчас на том же принципе построено целое направление в молекулярной диагностике — цифровая ПЦР.

Такие были наши научные достижения в условиях этого дифтерийного корпуса, с одной розеткой и одним ламинаром, с деревянными ПЦР-боксами. Кстати, был смешной эпизод: приехала корреспондентка «Нью-Йорк Таймс» брать интервью у Вадима Валентиновича Покровского, а он насколько он был впечатлен нашими работами, что решил ей показать лабораторию. Она заходит, а мы сидим в деревянных боксах, капаем, хорошо, что не деревянными пипетками. Она спрашивает: это что, лаборатория? И говорит: «Russian fanatics».

Представляете, вот так начиналась молекулярная диагностика. Игольчатый принтер, стопка сиквенсов, все вручную.

Был еще период переезда во второй корпус, тоже интересно. Когда нам стало совсем плохо в шестом корпусе, были комнаты в ЦНИИ эпидемиологии, от лаборатории масс-спектрометрии — тоже, кстати, передовая лаборатория, в Советском Союзе она была одной из первых. И вот она прекратила существование, все выехали в Израиль, в США. И мы в таких просторных комнатах на первом этаже построили лабораторию. Там тоже условия те еще были, постоянно водопровод прорывало, в какой-то момент воду прорвало так, что чуть до оголенных розеток не достало, могло просто поубивать всех. Вот так мы работали.

И потом нам удалось купить синтезатор олигонуклеотидов. Обычно мы заказывали синтез в других лабораториях, а тут купили свой. Химиков у нас не было, и я сам синтезировал олигонуклеотиды. Вспомнил свое детство — я с восьмого класса по десятый увлекался химией, у меня была химическая лаборатория дома, я в олимпиадах участвовал. Я вспомнил эту любовь к химии, освоил синтезатор и года три лично синтезировал олигонуклеотиды. Это все во Второй инфекционной больнице происходило. Второй корпус хороший, такой цивильный, в отличие от шестого дифтерийного корпуса, который снесли сейчас, он старый был, еще большевиками построен.

 

Четыре комнаты

Потом Валентин Иванович уже окончательно в нас поверил, и для этого были основания. Было разработано около 50 тестов, был маленький, но очень уверенный коллектив, и все технологии в наших руках. Были первые регистрационные удостоверения, уже несколько штук, были фармстатьи, но не было места, где производить тесты. Помню, еще во Второй инфекционной я с Валентином Иванович обсуждал эту тему, говорил: давайте развивать это дело. И он говорит: пиши бизнес-план. Потому что, по сути, речь шла о производстве.

Мы сели этот план писать, и я понял, что, конечно, молекулярная диагностика для нас вещь очевидная, но врачи в то время не были к ней готовы. Более того, даже заявление ВОЗ появилось в 1990-х годах о том, что ПЦР не рекомендуется для использования в диагностике ВИЧ в связи с контаминацией. Когда эта проблема возникла, чиновники испугались, и Вадим Валентинович несколько раз даже транслировал это мнение ВОЗ. Потом, когда Roche продавила эту свою историю, естественно, возовские чиновники взяли свои слова обратно, и нам легче стало. А некоторое время все очень скептически относились к этому направлению.

Когда мы первые тесты на хламидию сделали, основным тестом диагностики хламидиоза был флуоресцентный тест. Берется мазок, добавляются антитела, и в полной темноте сидит врач-лаборант, настраивает глаза, и потом смотрит, и там что-то светится, понимаете? И он говорит: там хламидия. Вот так тест был устроен. Это ужас, а не тест, он субъективный абсолютно. А мы давали объективную картину, с четким показателем чувствительности, специфичности. Но когда мы это все начали внедрять, ко мне как-то даже дерматовенерологи, с которыми мы сотрудничали, приехали на разборки. Они говорят, что ты тут эту фигню нам впариваешь, расскажи, что это у тебя такое? Я долго дискутировал с ними и довольно жестко. Они говорят: у нас основной тест — это флуоресценция, мы когда хотим, тогда и ставим диагноз. А ты со своими объективными знаниями суешься, ты нам бизнес ломаешь.

Да, я не сказал, что еще очень важное произошло в нашей лаборатории. Кроме праймеров, синтез которых мы наладили в ЦНИИ на купленном приборе, нужен был еще фермент для ПЦР, термостабильная полимераза. Первый фермент мы создали, наверное, в 1995-м. Этим занимался Владислав Безруков, он и сейчас со мной сотрудничает. Мы решили клонировать фермент. В Институте микробиологии была коллекция штаммов, советская программа по изучению термофилов, и был задепонирован штамм Thermus aquaticus, бактерии, у которой есть термостабильная Taq-полимераза. Мы купили у них этот штамм, стоил он три копейки тогда. Сами сделали среды — ходили в местный магазин, картошку покупали, чистили прямо в лаборатории, потому что для среды нужен крахмал. На этой среде вырастили штамм, нарастили в необходимом количестве, проамплифицировали ген. Отдали нашим коллабораторам из Института биоорганической химии, они сделали клон, Михаил Маркелов этим занимался. И прямо у себя в дифтерийном корпусе наладили производство фермента.

Но ведь и раньше уже с ПЦР работали. Значит, ферменты были?

Да. Еще в советское время в Гатчине, в Институте ядерной физики, были молекулярные биологи, которые сделали первый фермент. Этим ферментом пользовались или импортным, от PerkinElmer, гатчинский фермент был существенно дешевле. Потом, был советский Институт энзимологии в Литве, в Вильнюсе, и они тоже начали его производить. Когда Литва отделилась, Арвидас Янулайтис, советский биохимик, приватизировал все это и создал компанию Fermentas. Я с ним знаком был, ездил к нему в гости. Он мировую компанию построил из Института энзимологии и тоже этот фермент вывел на рынок. Несколько ферментов уже было, но мы сделали свой, и он до сих пор используется.

На картошке сделали.

На картошке, да. Потом мы так же ревертазу сделали, тоже проклонировали фермент. Соответственно, получили свои продуценты. То есть в 1990-е годы во Второй инфекционной больнице были созданы все технологии, все ферменты, синтез олигонуклеотидов, подбор праймеров и так далее. Больше 50 методик я лично разработал, сам выбирал все праймеры. Читал статьи, был основным идеологом всех тестов.

А потом случилось то, о чем мы долго мечтали. В 1999 году нас перевели в центральное здание ЦНИИ, на Новогиреевскую улицу. Дали нам на втором этаже несколько комнат с мойкой и аппаратом для очистки воды, который не работал. Стали мы думать, что делать: у нас есть 50 разработанных тестов, но нет производства. Надо было как-то выживать. И вот что мы придумали: в одной из комнат сделали производство, а параллельно начали выполнять исследования на тех зарегистрированных тестах, которые у нас уже были. Мы сделали первые в России количественные тесты на цитомегаловирус и на гепатиты В и С. Это было важно, потому что просто сказать, что есть вирус, — это ни о чем. Уже методы терапии появились, и надо было знать вирусную нагрузку у пациентов.

 

«Амплисенс»

Естественно, никто у нас эти тесты не покупал, но первые пациенты появились, и таким образом прошло, наверное, года два. То есть в 1999 году появилась идея коммерциализировать тесты, а в 2000 году мы сделали первые робкие попытки посмотреть на себя как на людей, которые смогут создать производство. И решили с Валентином Ивановичем, что производство будет в ЦНИИ, то есть государственное, но в то же время это предприятие должно быть участником коммерческого рынка.

Поэтому прежде всего надо было придумать бренд для нашей продукции. А тогда на рынке была Roche со своими тестами, у них был бренд Amplicor, и была компания Organon Teknika, у них был бренд NucliSens, и вот — недюжинная комбинация — мы скрестили эти названия и получился «Амплисенс», нам это очень понравилось. Никакие другие компании, ни «Литех», ни наши конкуренты ВСМ, которые тогда доминировали на рынке, не имели своих брендов. А у нас получилось необычное сочетание — есть ЦНИИ эпидемиологии, и есть наборы «Амплисенс». Торговая марка была зарегистрирована ЦНИИ эпидемиологии в 2000 году.

«Амплисенс» — это наборы реактивов. Что них входит?

Набор для выделения, набор для амплификации, набор для детекции, потому что первые наборы были на основе электрофореза, потом сделали наборы для гибридизационно-ферментного анализа, ГиФА.

Так появился «Амплисенс», мы создали небольшое производство и получили на него лицензию. В одной комнате был синтез олигонуклеотидов, в другой сборка наборов, в третьей — проверка. И параллельно по закуткам шла еще разработка. Очень тесно было. И все сотрудники работали на 0,25 ставки, это был конец 90-х.

Понятно, что непросто было все это вывести на рынок. Сыграло большую роль, что у нас был период накопления сил, 50 тестов были разработаны, ими можно было гордиться. Когда я сравнивал качество наших тестов с теми, что были на рынке, то видел, что мои наборы на тот момент были лучшими. И еще в них была заложена куча инновационных идей и технологий, которые потом позволили нам всех опередить.

Еще когда мы сидели во Второй инфекционной больнице, ко мне пришла студентка последнего курса Елена Богословская. Потом она закончила Первый мед, мы ее начали готовить, и со временем она стала одним из самых выдающихся разработчиков тестов, в первую очередь в области ВИЧ-инфекции, защитила докторскую по этой теме. И стали мы думать о том, как развивать ВИЧ-направление. Раз Вадим Валентинович Покровский в СПИДе главный, значит сам бог велел нам быть первыми в разработке этих тестов.

Тогда были попытки сделать отечественный тест на ВИЧ, но какие-то неуверенные. «ДНК-технология» пыталась что-то сделать, но практически поле было пустое, и только Roche со своими гибридизационно-ферментными тестами начала уже захватывать наш рынок. Мы решили ГиФА воспроизвести. Купили импортные планшеты и стали с помощью химической реакции пришивать зонды на поверхность планшета. Эта работа года два длилась, и году в 2003-м мы наконец этот тест сделали. Тест получился непростой для производства, но очень воспроизводимо и очень чувствительно работал и к тому же был количественным. Методика была непростая — это был ИФА, но с титровкой ампликона. То есть получаешь ампликон, начинаешь титровать ампликон вертикально по планшету и находишь те оптические плотности, где ридер работает в линейном диапазоне. Считываешь, потом умножаешь на разведение и относительно внутреннего контроля считаешь исходную вирусную нагрузку. Методология вся была создана на западе, но мы воспроизвели ее в наших условиях, причем так, что она не хуже работала, чем у Roche.

И вот к началу 2000-х у нас в стране бешеная эпидемия ВИЧ началась, и мы вышли на рынок. У нас была одна комната для производства, а нам дают еще три — и вот уже четыре комнаты, настоящее производство! У нас появился главный технолог, совсем юная девушка пришла, и уже три-четыре человека на производстве работают. И тогда мы сделали первые наборы для ВИЧ-детекции на основе гибридизационно-ферментного анализа. Это был уникальный набор, никто не мог такого делать, передовой набор, сделанный в Российской Федерации. Он был на уровне Roche по всем параметрам удобства работы, по чувствительности, но по цене в десять раз ниже. И мы вышли на Минздрав и выиграли несколько конкурсов на 400 миллионов рублей. Даже сейчас это большие деньги, а для того времени это нужно на два умножать.

«Здесь будет производство!»

Валентин Иванович был под впечатлением и решил, что нужно большое производство. Мы с ним пошли гулять по двору, у нас при входе была парковка, только что отремонтированная, и он такой стукнул палкой, как Петр Первый: здесь будет производство! И мы этот асфальт к какой-то матери снесли и быстро из ангаров построили производство, площадью, наверное, уже около 800 метров.

У нас появился руководитель производства, это отдельная история. Когда мы еще во Второй инфекционной сидели, я увлекался менингитами, подошел ко мне Юрий Яковлевич Венгеров с кафедры инфекционных болезней Третьего меда и говорит: у меня тут приехала аспирантка из Петрозаводска, Елена Николаевна Тютюнник, возьмешь ее к себе? Ей нужна экспериментальная часть работы. Вот так у нас появилась Елена Николаевна, в замужестве Родионова. И потом я был руководителем ее кандидатской, еще сам не будучи кандидатом. По сути, всему, что я в Голландии сделал, всем методикам я ее обучил. Интересную работу мы с ней сделали по диагностике менингита. Эти возбудители менингита плохо растут, поэтому при бактериологической диагностике чувствительность низкая. Мы смогли сделать по-другому. У нас по ПЦР-диагностике чувствительность была 75%, а по бактериологии — 20–30%. Потом она ушла врачом во Вторую инфекционную, но я ее уговорил вернуться, а потом и стать руководителем производства. Она им двадцать лет руководила, это совершенно выдающаяся персона в нашей жизни — Елена Николаевна Родионова.

Так вот зародилось производство. Ангары при входе нам верой и правдой служили практически до 2016 года. Производство в этих ангарах мы построили на заработанные деньги, у нас не было никаких инвестиций. И начался у нас четвертый этап, основной.

Большую роль в нашем развитии сыграли глобальные эпидемии и эпизоотии — тяжелый острый респираторный синдром SARS-1, который начался в Китае в 2002 году, птичий грипп в 2005-м, свиной грипп в 2009-м. А еще раньше была крупнейшая вспышка лихорадки Западного Нила. Я уже рассказывал на примере норовирусов, как простой подход изменяет все, дает возможность ответить на самый главный вопрос инфекциониста: видим ли мы в конкретном клиническом случае тот патоген, который вызвал эпидемию.

Мы для себя выработали правило: как только мы понимаем, что может произойти какое-то глобальное эпидсобытие, стараемся наладить производство тестов для данного патогена. Так было для лихорадки Западного Нила, для SARS-1 — Владимир Петрович Чуланов и Виктор Васильевич Малеев ездили в Китай и показали, как этот набор работает на фекалиях пациентов. В верхних отделах дыхательных путей он тяжело обнаруживается, а мы в результате получили чувствительность теста 95%, это была лучшая чувствительность в мире. С тестом на птичий грипп мы были первыми, с тестом на свиной грипп тоже — за несколько месяцев до того, как он появился в России, штамм нам передал CDC, я лично его растаможивал.

Ключевым сотрудником этого направления была Яцышина Светлана Борисовна, которую я пригласил к нам из Института эндокринологии. Она занималась секвенированием вируса лихорадки Западного Нила, а когда случился SARS-1, встал вопрос об организации группы, которая занялась бы разработкой тестов для выявления возбудителей острых респираторных заболеваний, и она ее возглавила.

Мы провели оснащение всех лабораторий СЭС, в будущем — Центров гигиены и эпидемиологии, оборудованием и реагентами, чтобы они могли делать тест на SARS-1. Вместе с сотрудниками ВОЗ организовали школу для всех сотрудников центров, написали руководство по тестированию. С этого, по сути, началась история молекулярной диагностики в Роспотребнадзоре. Аналогичные курсы вместе с ВОЗ мы провели повторно в 2009 году, когда произошла пандемия свиного гриппа на базе нашего учебного центра, силами наших специалистов. Было обучено несколько сотен специалистов Роспотребнадзора и стран СНГ. 

 

 

Теперь очевидно, что мероприятия по разработке, налаживанию производства и обучению в рамках подготовки к реагированию на возникновение таких пандемий, как SARS-1, свиной грипп и массы других менее крупных эпидемиологических событий были, по сути, репетицией перед пандемией COVID-19, происходила «настройка» производства и всего коллектива. Мы все это время отдавали себе отчет в том, что у нас должен быть действенный инструмент ответа на глобальные вызовы.

Когда случился ковид, вот тут-то стал нужен не просто тест — его нужно было выпускать в миллионных количествах. К моменту возникновения COVID-19 ЦНИИ эпидемиологии, к сожалению, потеряли лидерство, я тогда уже там не работал, и многие ключевые сотрудники тоже ушли. Первый тест в феврале сделали не они, а ГНЦ «Вектор». Второй тест сделал я, уже перейдя в другую организацию и не имея тогда вообще ничего — сделал, по сути, первый работающий тест в России. Я как бобер — знаете, если бобра перенести из одной реки в другую, он и там начнет плотину строить. И вся Москва работала на нашем ковидном тесте до конца осени 2020 года, в самое тяжелое время эпидемии.

Где-то в конце марта ЦНИИ эпидемиологии наконец тоже сделал тест, но зато они потом очень быстро нарастили объемы за счет того, что у них были колоссальные мощности производства, которое было до этого построено нами.

Выигрыш у Abbott, «Джин» и «Аладдин»

Расскажите о том, как создавались эти мощности. Как вы завоевывали рынок?

В бизнесе есть свои законы, нужно понимать объемы рынка, цены и, самое главное, что является хитами продаж. Мы быстро поняли, что в инфекционной патологии есть направления, где наборы ПЦР очень востребованы, и есть редкие заболевания, разработка и производство тестов для которых вряд ли повлечет возврат инвестиций. Я поделил инфекции на коммерческие и некоммерческие, это грубое определение, но точное. Если ретроспективно посмотреть на наши достижения, примерно 80% доходов от производства тест-систем нам приносили три группы заболеваний: урогенитальные инфекции, включая папилломавирусную инфекцию, ВИЧ и вирусные гепатиты. Урогенитальные инфекции по структуре сбыта и доходов занимали главенствующее положение, поэтому мы решили усилить это направление.

Что характерно для коммерческих инфекций? Для них должно быть лечение, они должны быть распространенными?

Вопросы коммерции сложные, не всегда это можно угадать. Должна быть высокая распространенность, они должны доставлять известные проблемы как пациенту, так и обществу, и должны быть препараты для лечения. Урогенитальные инфекции идеально подпали под эти критерии. ВИЧ у нас курировала Елена Богословская, о которой я уже рассказывал. Гепатитами занималась лаборатория Чуланова. А в начале 2000-х к группе разработчиков тестов, которую я сформировал, присоединился Гущин Александр Евгеньевич, он проработал в ЦНИИ больше 20 лет. В ЦНИИ он стал заведующим лабораторией, которая занималась инфекциями репродуктивных органов. С завидным упорством и целеустремленностью он взялся за разработку всей линейки тестов на урогенитальные инфекции. По сути, он создал все это направление урогенитальных инфекций, разработал наибольшее количество тестов в России. Тут надо также упомянуть его неизменную соратницу Юлию Савочкину — наверное, одного из самых опытных разработчиков в стране.

Что еще важно — эти тесты были сделаны на основе идеи синдромального подхода. Это в свое время была инновационная идея, и мы к этому пришли в конце 1990-х раньше западных коллег. Если мы имеем совершенный тест, который позволяет с эффективностью до 100% выявлять этиологический агент, то, разработав тесты для выявления наиболее частых патогенов при том или ином синдроме, например, при урогенитальной инфекции, мы сможем расшифровать большую часть случаев. До наших работ не было методов с такой высокой эффективностью расшифровки, и эти методы оказались востребованы врачами.

Количество тест-систем для выявления урогенитальных инфекций на протяжении всего существования нашего производства росло в среднем на 20% в год. Конечно, большую роль в этом играл отдел сбыта ЦНИИ эпидемиологии, его возглавляла вначале Ирина Андреевна Гущина. Можно сказать, что без нее наборы производства ЦНИИ эпидемиологии так бы и остались нишевой научной разработкой и не смогли бы занять значительную долю рынка молекулярной диагностики в России.

Наборы для выявления инфекций, передающихся половым путем, стали основой нашего экономического роста. Гепатиты занимали около 20%, а что касается ПЦР-наборов на ВИЧ, это зависело не только он нас, но и от активности конкурентов, в первую очередь Abbott и Roche.

В 2000-е годы было еще одно событие в плане конкуренции, для нас не очень приятное. «Вектор-Бест» был в то время не очень активный в разработке ПЦР-наборов, потом они набрали хороших людей и выстрелили, ВСМ тогда как-то просел, «Литех» развивался, но не очень энергично. А основным конкурентом была «ДНК-технология». Дело в том, что мы в ЦНИИ не могли разрабатывать оборудование, только тесты. А у «ДНК-технологии» была база в Протвино, и там работали инженеры-электронщики, которые первые амплификаторы построили в России, прибор назывался «Терцик».

Потом случилась эпоха реалтайма, ПЦР в реальном времени. Был форез, потом мы придумали ГиФА, единственные в стране, и думали, что будем почивать на лаврах. Но наука не стоит на месте, и появился реалтайм. Естественно, зарубежные коллеги из Applied Biosystems и BioRad первыми разработали приборы, а компания Abbott разработала первый в мире тест на основе реалтайма для определения вирусной нагрузки ВИЧ. Они нашли здесь себе коллаборатора, организовали российскую сборку наборов и бесплатно поставили около 40 приборов в центры СПИД, которые работали с нашими ГиФА-наборами. С 2003 по 2005 год мы два раза выиграли конкурс по 200 миллионов, 400 миллионов заработали, а потом все стали переключаться на реалтайм, потому что он гораздо удобнее. Это лаборатория на одном столе: выделяешь ДНК, ставишь в прибор и получаешь результат через полтора часа. А в нашем случае нужно выделить ДНК, поставить ПЦР и провести ИФА. Методика очень хорошо работала, но она дольше.

И стали мы думать, как ответить Abbott. Надо было разработать такой же тест. У меня были очень талантливые молодые люди в то время, ими Дмитрий Куевда руководил. У Abbott не было штрихкодов, и мы смогли разработать полный аналог теста Abbott, зарегистрировать его.

И на эти 40 приборов был тендер, не помню, 200 или 300 миллионов, мы вышли на него и выиграли его по нашим ценам. Вы не представляете, какой был скандал! Конкуренты писали жалобы. Геннадий Григорьевич Онищенко, который тогда был руководителем Роспотребнадзора, не понял, что произошло, меня допрашивали, что я такое устроил, что за шум. Но потом, когда разобрались, мне он даже благодарность объявил за создание этого набора. В начале 2000-х еще были сильны лоббистские структуры. Меня обвиняли в том, что мой тест не работает, что я прибор поломал, залез несанкционированно на чужой прибор, и так далее. Американцы приехали ко мне в ЦНИИ эпидемиологии, а потом меня пригласили в Сан-Диего, я ездил к ним на разборки по поводу этого теста вместе с Дмитрием Куевдой. А потом они поступили более хитро — просто ограничили работу нашего теста с помощью штрих-кодов.

 

Но сейчас везде реалтайм-ПЦР, и российские приборы есть. Как вы подошли к реалтайм-ПЦР?

Был еще промежуточный этап. Я подсчитывал, естественно, ежегодный объем рынка, который ЦНИИ имел, мы прямо по годам смотрели. Когда у меня был форез, мы занимали 70% рынка, не было «Вектор Беста», была «ДНК-технология». Но еще до того, как случился реалтайм и Abbott залез на рынок, Дмитрий Трофимов из «ДНК-технологии» изобрел прибор, который называется «Джин». Это настольный детектор: ты ставишь ПЦР, запускаешь этот детектор, по конечной точке он детектирует флуоресценцию, и сразу получаешь результат, не нужно форез делать. Мы поехали на выставку здравоохранения, где он впервые это экспонировал. Помню, у людей там оторопь была — как это так, вся страна работала на форезе, и вдруг появляется вот такой приборчик. Он еще тайно это все делал, чтобы никто не знал. И я подумал: либо мы выживем, либо нет. Потому что ГиФА не побеждала «Джин», ГиФА хороша была для ВИЧ, а для остальных инфекций дорого получалось и сложно. А «Джин» — это, по сути, прообраз реалтайма был, но реалтайм кинетику снимает, а здесь конечная точка. Количественно он не работал, только качественно.

Мы всю голову сломали, как их обойти, и, наконец я нашел партнера в Латвии — это был Василий Банковский, компания «Биосан». Он ко мне приехал, я говорю: Вась, спасай. Он отвечает: такой прибор я не сделаю, там каскадная технология, она только в России развита активно, но могу на ФЭУ, фотоэлектронном умножителе сделать прибор. О, кстати, говорит, у меня есть корпус от центрифуги, я туда, наверное, его вмонтирую. Взял корпус от центрифуги, поставил туда ФЭУ и ротор. Схема несложная.

Как назовем? Джинн подчинялся кому? — Аладдину. И прибор назвали «Аладдин», АЛА-1, то есть автоматический люминесцентный анализатор первый. Таким образом мы смогли догнать «ДНК-технологию». Потом появились реалтайм-приборы, и, конечно, эти технологии, «Джин» и «АЛА-1», с рынка ушли. Но еще в 2018 году в нашей ПЦР-лаборатории, наверное, две трети потоков проб обрабатывались на этом «Аладдине», все качественные реакции делались таким образом. А потоки к тому времени сильно выросли.

Новый этап

Еще в 2004–2005 году я понял, что на этих 800 метрах мы долго не просидим. К этому времени мы сильно укрепились материально. Мы построили две лаборатории синтеза олигонуклеотидов, к сожалению, помещений своих не было, но по научному договору одна из них сидела в Институте биоорганической химии, другая еще в одном институте. И мы полностью обеспечивали себя ферментами, которые создали во Второй инфекционной больнице. Это были не только ферменты для ПЦР, но и всевозможные ревертазы, и ферменты для борьбы с ампликонами и прочее, вся необходимая база. И встал вопрос о большом производстве.

Я пришел к Валентину Ивановичу: как бы нам построить большое производство? Он говорит: давай напишем в правительство предложение, мы же государственная структура. Премьер-министром тогда был Михаил Ефимович Фрадков. Мы ему написали, что нам нужно национальное производство тестов, и попали в целевую программу по госинвестициям, то есть через Минэкономразвития. Я целый год работал как чиновник, бегал по кабинетам, собирал подписи, вера была небольшая, что нам дадут эти деньги. Но дали все-таки, и мы где-то в 2006 году начали строить. У нас был пустырь на заднем дворе, это была часть Терлецкого парка — тоже отдельная история, потому что Терлецкий парк — охраняемая природная зона, но часть его была на нашей территории. И мы смогли убедить всех и получить деньги.

Мы должны были построиться в 2011 году, стройка чуть затянулась, но в результате мы построили самое большое производство ПЦР-тестов на территории России. Это наш четвертый этап.

В это время коллектив у меня разросся. Если в дифтерийном корпусе у нас работали четыре человека, то в 2005 году я стал руководителем Отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ЦНИИ эпидемиологии, и у нас появилось два бренда — «Амплисенс» и CMD (центр молекулярной диагностики). CMD я вначале рассматривал как референс-центр, но он постепенно коммерциализировался и стал коммерческим брендом. В Отделе молекулярной диагностики и эпидемиологии работало на тот момент уже около тысячи человек. И мы построили самое большое производство и самую большую ПЦР-лабораторию в стране, площадью уже полторы тысячи метров, она до сих пор существует в ЦНИИ.

Новое производство было запущено где-то в 2016 году, в этом огромную роль сыграла Елена Николаевна Родионова. У нас появились шикарные главные технологи, сперва Ермакова Наталья была, потом Петрова Наталья, сейчас она там руководит. И за эти годы, с 2000 года по 2018-й, когда я уволился, мы выпускали больше 350 различных тестов. Получается, что мы в год создавали и регистрировали около 20 тестов, представляете, какие темпы мы набрали. Регистрация одного набора может занимать около года и более. И тут нам, конечно, очень повезло, еще в начале 2000-х к нами присоединилась Марина Вячеславовна Козицина — человек незаурядный, посвятивший всю свою жизнь такому вот, казалось бы, скучному занятию — регистрации наборов. Но без ее труда мы бы не смогли выйти на упомянутые выше чемпионские скорости вывода наборов на рынок.

 Было около 150 ученых, которые занимались разработками, 11 научно-исследовательских групп было создано: острых респираторных заболеваний, кишечных инфекций, ВИЧ, туберкулеза, менингококковых инфекций и так далее. Была группа развития производства, группа ферментов, и многие люди, которые возглавляли эти группы, сейчас работают в других организациях на высоких постах.

Да, я еще не сказал, что я за это время провел 20 конференций по молекулярной диагностике. А еще мы построили учебный центр — это моя гордость. Я сам написал учебные курсы в 2000-х годах, три года их лично читал. Тренировался на ГИСКе, меня там попросили прочесть курс лекций, потому что они ничего не понимали в ПЦР. Мы с Леной Богословской ездили туда, и я читал профессорам ГИСКа лекции по молекулярной биологии. Потом эти курсы легли в основу учебных курсов для всей страны. У меня курсы были и в Киеве, в Алма-Ате, в Петербурге были курсы — весь Северо-Запад мы учили, в Екатеринбурге, в Новосибирске.

Где-то в 2016 году я пришел к Анне Юрьевне Поповой, тогда уже она была во главе Роспотребнадзора, и говорю: надо бы курсы по ПЦР на Дальнем Востоке открыть. И мы открыли курсы на острове Русский, на базе Дальневосточного федерального университета. И не только для нашего Дальнего Востока, но и для всей Юго-Восточной Азии, к нам приезжали из Вьетнама, Лаоса, Камбоджи. Надежда Петровна Николаева, руководитель учебного центра, соратник наш, ездила по всей стране, всех учила. Мы получили лицензию на обучение, двухнедельные курсы повышения квалификации стоили три копейки. Мы обучили, наверное, семь-восемь тысяч человек, от Петербурга до Дальнего Востока.

Вся эта грандиозная работа, проделанная мной и моими соратниками, по сути, стала подготовкой к самой большой эпидемии XXI века, коей стал ковид. Построенное нами производство площадью 6000 метров, коллектив больше полутора тысяч человек, более 10000 лабораторий, оснащенных ПЦР-оборудованием, и школа по подготовке специалистов — вот та база, которую мы заложили и которая позволила нашей стране в короткие сроки нарастить объемы тестирования ковид на уровне мировых.

Ну, потом случилось то, что случилось: в 2018 году Валентин Иванович Покровский заболел и покинул свой пост, пришли новые люди в ЦНИИ, и в 2018 году мне пришлось уволиться и сменить место работы. Сейчас в ЦНИИ эпидемиологии продолжается жизнь на ранее заложенных идеях, производство до сих пор остается самым крупным в России среди предприятий, выпускающих молекулярные тесты. И единственным государственным — все остальные коммерческие.

Что будет дальше — каким вы видите будущее молекулярной диагностики в мире и в России?

Прежде чем ответить на этот вопрос, я хотел бы порассуждать о лидерстве и новых идеях. Мне повезло учиться на одном курсе со старшим сыном Андрея Тарковского, Арсением. От него я услышал секрет успеха, который ему поведал его отец: нужно быть первым в профессии, которую выбрал. Я это запомнил и старался всю жизнь быть лидером в той области, которой посвятил 30 лет своей жизни, — молекулярной диагностике инфекций. Чтобы это заявление не звучало слишком самоуверенно, уместно еще раз подвести некоторые итоги этого этапа нашей работы.

Количество публикаций — более 900, более 30 патентов, 14 монографий, большинство из них посвящены молекулярной диагностике.

Создан самый большой в России коллектив, который продолжает заниматься молекулярной диагностикой, построено самое большое на тот момент производство наборов реагентов, с мощностью более миллиона наборов в год. При этом все ключевые компоненты для ПЦР были созданы и производились в ЦНИИ эпидемиологии.

Был зарегистрирован и производился рекордный перечень ПЦР-наборов — более 350 наименований, около тысячи разновидностей.

На протяжении 27 лет наш коллектив всегда был первым в разработке тестов для индикации патогенов, вызывающих крупные вспышки инфекционных заболеваний.

Разработана нормативная база в области организации ПЦР-лабораторий.

Создана сеть ПЦР-лабораторий Роспотребнадзора (более ста) и сеть коммерческих лабораторий (сейчас их более 10 тысяч).

Создана на базе ЦНИИ эпидемиологии самая большая школа обучения специалистов молекулярной диагностике.

Проведено более 20 конференций «Молекулярная диагностика».

Таким образом, думаю, что я могу выступить с позиции эксперта. И здесь важно подчеркнуть, что кроме стремления «быть первым в профессии», для лидерства необходим второй, даже, наверное, более важный компонент — нужны новые идеи. Там, где нет новых идей, лидерство будет утрачено.

Новые идеи в молекулярной диагностике на данном этапе ее развития — это прежде всего мультиплексные системы, которые выявляют сотни мишеней, а не одну и не тридцать. Такие системы можно создать и на основе ПЦР, они уже очень далеко ушли от форезов Кэри Муллиса. Возбудителей тех же гастроэнтеритов или респираторных заболеваний очень много, и если их детектировать по одному, то 100% расшифровки этиологии не удастся достичь. Сейчас широко распространились автоматизированные станции для тестирования, но они идут в другом направлении: очень большое количество образцов и малое количество мишеней, которые можно детектировать, только самые распространенные и коммерчески выгодные. Но тут мы пока идем в ногу со временем — в России уже научились делать автоматические системы, которые за 20 минут могут детектировать до сотни патогенов. В ближайшие пять лет будут созданы производства таких приборов и тест-систем. Все это позволит нашей стране занять лидирующие позиции в части повышения эффективности расшифровки инфекций.

Следующее бурно развивающееся направление — секвенирование следующего поколения (NGS), но в диагностике инфекций сейчас оно имеет ограниченное применение. Метод дорогой, чувствительность низкая, кроме того, нужно дожидаться, пока наберется сразу много проб для запуска. Конечно, требуются значительные усилия по созданию новых отечественных приборов для NGS и, самое главное, реагентов к ним. В России разработаны несколько приборов, но идет копирование того, что сделано за рубежом. И копируются устаревшие образцы импортных изделий. Тут как никогда полезен совет «перегонять, не догоняя».

И следующий этап в развитии молекулярной диагностики после ПЦР и NGS — это протеомика высокого разрешения, определение биологически возможного количества белков в клиническом материале. До недавнего времени не было возможности детектировать все их разнообразие, не хватало чувствительности приборов. Новый этап происходит на наших глазах, я бы назвал его Великой Протеомной Революцией. Ларри Голд основал компанию SomaLogic, они создали технологию детекции белков плазмы с помощью аптамеров, которая может выявить во много раз больше белков, чем другие – до 12 тысяч белков в образце. Джон Хаймер создал компанию Olink, они научились с помощью специфических антител детектировать до 6 тысяч белков. Их уже купила компания Thermo Fisher, крупнейший игрок молекулярного рынка — а Illumina, не менее крупный игрок, купила SomaLogic. То есть компании, которые поднялись на анализе нуклеиновых кислот, теперь занялись протеомикой. Коль скоро вот такой прорыв будет дополнен искусственным интеллектом и таким образом будут накоплены данные анализа биобанкированных образцов от пациентов с самой различной патологией на разных стадиях развития заболеваний, мы сможем не только с высочайшей точностью диагностировать любые болезни, но и предсказывать их задолго до возникновения симптомов.

Что у нас на этом направлении? В общем-то, ничего. Россия — вне этой технологической революции. У нас нет таких решений для массового анализа протеома, и никто этим не занимается. Поэтому нужны системные усилия, грантовая поддержка, может быть, нужен Институт протеомики. И конечно, необходимы отечественные аналоги приборов, которые уже есть на мировом рынке, — хромато-масс-спектрометры с высоким разрешением, NGS-секвенаторы, микрофлюидные анализаторы и огромные пулы антител или аптамеров для специфической детекции белков.

Вот этим надо заниматься, и я планирую посвятить этим направлениям следующие 30 лет своей жизни.

Беседовала Надежда Маркина