«Найди и замени» — новый многофункциональный метод редактирования генома

Разработан высокоточный и многофункциональный инструмент для редактирования генома на базе нуклеазы Cas9, в котором скомпенсированы недостатки ранее существующих методов.

Credit:
Juan Gaertner | Shutterstock.com

Методы редактирования геномов, основанные на системе CRISPR-Cas, приобрели широкую популярность, однако они имеют свои недостатки. Использование традиционной нуклеазы Cas9 приводит к двунитевому разрыву ДНК в сайте-мишени, после чего в клетке запускаются механизмы репарации. Результат работы этих механизмов не контролируется исследователем, и на месте разрыва образуются инсерции или делеции случайного размера. Даже в случае введения ДНК-матрицы, в клетке происходят непредсказуемые делеции и вставки нуклеотидов. Кроме того, применение CRISPR-Cas приводит к случайным мутациям вне сайта-мишени.

Группа ученых из Института Брода разработала новый точный метод редактирования геномов на базе нуклеазы Cas9, который не требует ни двухцепочечных разрезов, ни дополнительных фрагментов ДНК, но при этом обладает высокой точностью и функциональностью. Главный автор работы, Дэвид Лиу, сравнивает методы внесения изменений в геном через двунитевые разрезы ДНК с ножницами. Кроме ножниц, по его мнению, существуют карандаши: методы точечного редактирования оснований без разрыва ДНК. В процессе такого редактирования происходит химическое превращение одного основания в другое. И ножницы, и карандаши имеют явные ограничения. Команда Дэвида Лиу поставила своей задачей создание полноценного «текстового редактора», позволяющего вносить как точечные мутации, так и длинные инсерции и делеции в сайте-мишени.

Авторы назвали новую систему редактирования генома prime editing. Система включает каталитически ослабленную нуклеазу Cas9, сшитую с обратной транскриптазой (RT), и новый вариант гидовой РНК — prime editing guide RNA (pegRNA). pegRNA не только направляет нуклеазу к нужному сайту ДНК, но и является матрицей, кодирующей изменения, которые необходимо в этом сайте внести. Механизм работы системы можно описать как «найди и замени». Сначала белок Cas9-RT, направляемый pegRNA, садится на ДНК и разрезает одну цепь ДНК. Затем обратная транскриптаза достраивает нить в месте разреза, используя pegRNA в качестве матрицы. После этого Cas9-RT разрезает вторую нить, и начинают работать клеточные механизмы репарации ДНК: место разреза достраивается на отредактированной матрице первой цепи, что максимально исключает возможность случайных изменений в сайте редактирования.

Авторы проверили prime editing на четырех человеческих клеточных линиях и культуре мышиных корковых нейронов. Всего в процессе работы было внесено 19 инсерций длиной до 44 пар оснований, 23 делеции длиной до 80 пар оснований, 119 точечных мутаций, из них 83 трансверсии, и 18 комбинированных правок в 12 эндогенных локусах.

Одной из важнейших задач геномного редактирования является лечение генетических заболеваний. Ученые успешно применили prime editing для корректировки в культурах человеческих клеток причин серповидноклеточной анемии (трансверсия в гене HBB) и болезни Тея-Сакса (требовалась делеция в гене HEXA), внесли защитную трансверсию в ген PRNP. При этом количество случайных мутаций было значительно ниже, чем при использовании Cas9.

Ограничением prime editing, не позволяющим ему заменить все существующие инструменты редактирования на базе нуклеаз, является длина pegRNA. Для внесения длинных инсерций или делеций необходима длинная молекула РНК, однако чем она длиннее, тем выше вероятность ее повреждения ферментами клетки. Ученые работают над этой проблемой. Сейчас они обратились к публичной базе данных ClinVar, в которой собраны 75 122 патогенных генетических варианта для человека, и подсчитали, что 85–99% патогенных мутаций затрагивают 30 и меньше пар оснований, то есть, prime editing может скорректировать около 89% патогенных вариантов.

Институт Брода лицензировал новую технологию геномного редактирования для терапии компании Prime Medicine, которая в свою очередь предоставила сублицензию Beam Therapeutics.

Источники

Anzalone AV, et al. // Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. // Nature, 2019; DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4

Материалы ресурса Genome Web.
Добавить в избранное

Вам будет интересно