Система Target-AID позволяет быстро и точечно редактировать геном лактобацилл

Лактобациллы играют важную роль в пищевой промышленности, а также в получении пробиотиков и терапевтических средств. Для создания более полезных штаммов необходимо вводить целевые признаки в каждый конкретный штамм, чтобы затем усиливать или комбинировать их. Однако для практического использования в качестве пробиотиков или продуктов питания организмы с трансгенами не всегда применимы. Японские ученые разработали систему редактирования оснований специально для лактобактерий, позволяющую с высокой эффективностью вносить множественные точечные мутации в их геном.

В качестве мишени редактирования авторы выбрали ген уроканатредуктазы (urdA). Этот фермент играет ключевую роль в синтезе пропионата имидазола — метаболита, ассоциированного с нарушением глюкозотолерантности и инсулинового сигналинга при диабете 2 типа.

В систему редактирования, названную Target-AID, авторы включили следующие компоненты: никазу Cas9 (nCas9), деаминазу PmCDA1, ингибитор урацилгликозилазы UGI, который блокирует начальный этап эксцизионной репарации оснований, а также CRISPR-РНК (crRNA) и трансактивирующие CRISPR-РНК (tracrRNA). Три эффекторных белка (nCas9, PmCDA1 и UGI) разместили в составе единой полицистронной кассеты под одним промотором.

Применимость системы CRISPR-Cas9 ограничена необходимостью в прилежащих протоспейсерных мотивах (PAM). Для расширения потенциала системы ученые выбрали упрощенный вариант Cas9 с измененными требованиями к PAM — NG-Cas9 работает с PAM-последовательностью из двух нуклеотидов. Наработав в клетках Escherichia coli варианты целевых плазмид Target-AID-NG для редактирования генома лактобацилл, авторы протестировали их на Lactiplantibacillus plantarum.

Плазмиды pYK06-d и pYK06-t обеспечивали редактирование оснований во всех трех сайтах-мишенях, на которые были нацелены их crRNA-кассеты. Эффективность достигала 100% за один раунд редактирования (трансформации и селекции), и авторы подчеркивают, что при использовании системы рекомбинации для такой же инженерии потребовалось бы не менее трех раундов.

Внесение целевой мутации в ген urdA ученые подтвердили секвенированием по Сэнгеру, после чего оценили, как изменился синтез пропионата имидазола в отредактированных бактериях. Метод жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC/MS) выявил более чем десятикратное снижение уровня этого метаболита по сравнению с диким типом.

Применимость проверили и на других видах лактобацилл, а именно Lactobacillus gasseri. Оказалось, что исходная система редактирования, предназначенная для L. plantarum, не обеспечивает должной эффективности внесения точечных замен, однако ее смогли адаптировать, заменив промотор на более подходящий для экспрессии в бактериях этого вида.

Таким образом, созданная система редактирования оснований Target-AID позволяет эффективно и точно осуществлять генетические манипуляции сразу в нескольких локусах генома Lactobacilli. Это перспективный генетический инструмент, и авторы надеются, что он ускорит как прикладные, так и фундаментальные исследования, связанные с лактобациллами.

«Полученные нами бактерии не подпадают под действие норм, касающихся генетически модифицированных организмов при использовании их в качестве продуктов питания, добавок или лекарств, — подчеркивает руководитель группы Кэйдзи Нисида (Университет Кобе, Япония), рассказывая о разработке. — Поэтому мы ожидаем, что после соответствующего подтверждения безопасности их легко будет сделать коммерчески доступными».

Для создания нового пробиотика бактерию приучили к кислороду