Сконструирован вирусный вектор для редактирования генома пшеницы и других однодольных растений

Из-за увеличения численности населения и изменения климата существует острая необходимость в повышении урожайности сельхозкультур. В настоящее время селекционеры активно используют методы генной инженерии, в том числе и CRISPR-Cas-редактирование генома. Исследователи из Китая создали вектор, который подходит для доставки редактирующей конструкции CRISPR-Cas в клетки злаков, в том числе пшеницы — одной из важнейших зерновых культур в мире.

Редактирование генов растения состоит из двух этапов: собственно редактирование генома клетки и получение растения с модифицированным геномом. Поскольку редактирование, как правило, не затрагивает генеративные ткани, растения с отредактированным геномом могут быть выращены из отредактированных соматических тканей, например, листьев. Однако для однодольных растений характерна низкая эффективность регенерации, поэтому для них нужны векторы, способные проникать репродуктивные органы и (или) в клетки меристемы — интенсивно растущей ткани с максимальной регенеративной компетенцией.

Редактирующие конструкции вводят в растительные клетки с помощью агробактериальной или биобаллистической трансформации. Но у этих методов есть недостатки — малое количество трансформируемых генотипов, низкая эффективность регенерации, длительный срок получения гомозиготных растений. Для решения данных проблем можно использовать вирусные векторы. Большинство вирусов не заражает меристему растения, но существуют различные способы преодоления этого ограничения.

Векторы на основе (+)РНК-вирусов широко распространены, однако не способны непосредственно доставлять нуклеазу Cas9. Эти векторы могут доставлять направляющие РНК (sgRNA) в трансгенные растения, стабильно экспрессирующие Cas9, таким образом индуцируя в них редактирование генов. (-)РНК вирусы благодаря палочковидной структуре вириона, способного к расширению, и низкой гомологичной рекомбинации инкапсулированных геномных РНК имеют большую грузоподъемность и способны доставлять в клетку нуклеазу Cas9 и sgRNA. Но и эти векторы неидеальны: существующие варианты не позволяют регенерировать генноотредактированные однодольные растения с достаточной эффективностью.

Команда китайских ученых создала вектор на основе вируса желтой полосатой мозаики ячменя (BYSMV). В природе он заражает более 26 видов однодольных растений, его переносчиками являются темные цикадки Laodelphax striatellus. Этот вектор одновременно экспрессировал нуклеазу Cas9 и sgRNA, нацеленную на ген TaPDS фитоендесатуразы пшеницы (на все три гомеоаллеля этого гена). Фермент фитоендесатураза участвует в пути синтеза каротиноидов, и его нокаут приводит к обесцвечиванию растения на свету, что удобно для скрининга.

Вирусный вектор авторы получали в листьях Nicotiana benthamiana. Плазмиды, кодирующие Cas9 и sgRNA, а также белки, необходимые для репликации вируса, и вспомогательный фактор, усиливающий их накопление, вводили в клетки методом транзиентной агроинфильтрации (делали инъекцию генетически модифицированных агробактерий, несущих плазмиды, в межклеточное пространство). Полученные таким способом рекомбинантные вирусы были перенесены при помощи цикадок в растения пшеницы (культивируемый сорт Kexing3302).

Белок Cas9 накапливался в инфицированных растениях, эффективность соматического редактирования составила около 50%. Однако случайные мутации редактирования, вызванные вирусной инфекцией, не были унаследованы сеянцами потомства.

Ранее было показано, что вирусный вектор может доставлять направляющие РНК, слитые с мобильной последовательностью TLS (transfer RNA^Met-like structure — «структура, подобная метиониновой транспортной РНК»), и она индуцирует наследуемое редактирование в Cas9-трансгенных растениях. Слитые с TLS мРНК способны перемещаться из трансгенных корней в листья и из трансгенных листьев в корни или цветы. 

Ученые создали еще один вектор, в котором гены Cas9 и sgRNA были слиты с TLS. Такой вектор показал повышенную инфекционную активность в N. benthamiana и растениях пшеницы. По сравнению с вектором, не содержавшим TLS, в них выросло количество белка Cas9 в растениях и повысилась эффективность соматического мутагенеза.

Вирусная инфекция вызвала кущение зараженных растений — образование обильных побегов с классическими симптомами кустистости и карликовости. В экспериментах, где вирус доставлял флуоресцентный белок, интенсивность флуоресценции была высокой в узлах побега. Это позволяло предположить, что вектор с TLS вызвал обширную инфекцию в пазушной меристеме.

Для доказательства данной гипотезы ученые удалили основные стебли растений пшеницы, чтобы стимулировать кущение. Некоторые побеги были обесцвеченными (похожими на мутанты с нокаутом гена TaPDS) и при этом не содержали белков или РНК Cas9 и BYSMV. Секвенирование ампликонов, охватывающих сайт-мишень, показало 100%-ную общую эффективность редактирования в трех гомеоаллелях TaPDS. Листья на одном побеге имели одинаковые паттерны мутаций, а на разных побегах — различные. Все это подтверждало, что редактирование произошло в пазушной меристеме, а не в разных участках уже выросшего листа.

Чтобы проверить, наследуются ли мутации, авторы получили проростки из зерен колосьев на обесцвеченных побегах. В общей сложности около 10% растений, инфицированных вирусным вектором, могли отращивать побеги с отредактированным геном.

Авторы также протестировали редактирование генов с помощью BYSMV на различных сортах пшеницы и провели редактирование генов, не влияющих на визуальные проявления фенотипа. Например, в качестве мишени выбрали ген эукариотического фактора инициации трансляции 4E (TaeIF4E), отвечающего за устойчивость к растительным потивирусам. Ген эффективно редактировался в соматических клетках инфицированных растений. Семь из 95 растений дали безвирусные генноотредактированные побеги, включая множество химерных мутантов, а также девять биаллельных или гомозиготных мутированных побегов. 

Таким образом, доказано, что BYSMV-опосредованное наследуемое редактирование может применяться для редактирования различных генов однодольных растений. В заключении авторы подчеркивают широкие перспективы нового вектора. Поскольку BYSMV заражает большинство сортов пшеницы, а также другие виды однодольных растений, векторы на основе данного вируса могут применяться для редактирования многих важных сельхозкультур. Возможно множественное редактирование генов путем экспрессии тандемных sgRNA, что позволяет проводить селекцию по многим признакам сразу. Кроме того, вектор BYSMV может применяться для доставки редакторов оснований, осуществляющих точечное редактирование.

Опубликован полный референсный геном ржи