Нуклеазу Cas12 научились нацеливать с помощью гидовых ДНК, а не РНК

Технологии генного редактирования с помощью CRISPR-Cas широко применяются для исследования клеточных процессов, диагностики заболеваний и разработки методов терапии. Нуклеазы Cas12 используют направляющие, или гидовые РНК для нацеливания на ДНК-мишень, которую они расщепляют. А что если поменять ДНК и РНК местами? Это сделали авторы статьи в Nature Biotechnology, которые адаптировали Cas12 для нацеливания на РНК с помощью гидовой ДНК.

Сперва ученые проверили, как длина каркасной части гидовой РНК влияет на расщепление нуклеазой Cas12i1. Они убедились, что даже полностью лишенные консервативного каркаса РНК способствуют расщеплению ДНК-мишеней. Подтвердив эту возможность на другом ортологе Cas12 (AsCas12), авторы заменили бескаркасную гидовую РНК на комплементарную ей ДНК. Такую систему протестировали на синтетических микроРНК, и оказалось, что в дуплексе РНК:ДНК нуклеаза расщепляет именно РНК. Однако активность проявляла только Cas12i1. Чтобы обеспечить возможность использования и AsCas12a, авторам потребовалось внести ряд модификаций в гидовую ДНК. Такой синтетический вариант они обозначили как ΨДНК. 

Для новой платформы исследователи рассмотрели два применения: молекулярную диагностику и управляемую посттранскрипционную регуляцию генов. Для клинического применения — детекции вирусных геномов в образцах — авторы провели ПЦР с обратной транскрипцией, а затем провели транскрипцию с полученной амплифицированной ДНК. Полученные ампликоны РНК вируса гепатита С (ВГС), вируса денге и вируса Зика ΨДНК–Cas12 детектировала на пикомолярном уровне. Из 40 образцов вируса гепатита С (20 положительных и 20 отрицательных) ΨДНК, нацеленная на 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) гена E2, обеспечила детекцию всех положительных образцов с генотипом 1a и 1b. А ΨДНК, нацеленная на сам ген E2, избирательно детектировала генотип 1a (все результаты подтвердили NGS-секвенированием). Общая диагностическая точность составила 100%. 

Затем авторы оценили функциональность комплекса ΨДНК–Cas12 в живых клетках. Для создания репортерной системы они внесли в клетки HEK293T две плазмиды: одна кодировала AsCas12a, помеченную GFP, а другая mCherry. Также в клетки внедрили ΨДНК, нацеленные на мРНК mCherry. Все протестированные варианты ΨДНК снижали интенсивность флуоресценции mCherry, и измерение относительного уровня РНК также показало, что экспрессия в присутствии AsCas12a и ΨДНК избирательно снижалась. 

Чтобы оценить способность системы избирательно подавлять эндогенные транскрипты РНК в клетках HEK293T, ученые сконструировали ΨДНК, специфичные к транскриптам трех генов — PPIA, RPL4 и PCSK9. Затем они трансфицировали HEK293T одной из этих ΨДНК в сочетании с GFP (в качестве отрицательного контроля) либо AsCas12a. Частичное снижение целевых мРНК наблюдалось и в контрольных клетках, вероятно, из-за того, что ΨДНК формировала дуплексы с мишенью и подавляла ее подобно тому, как это делают антисмысловые нуклеотиды. Но в присутствии AsCas12a эффект был намного более выраженным. В целом уровни мРНК соответствующих генов снижались на 50–70% по сравнению с контролем. Что особенно важно, уровень нецелевой активности был существенно ниже, чем у нуклеазы Cas13 (их как раз обычно используют для редактирования РНК). Частота нецелевого редактирования новой системы оказалась в 17,7 раза меньше для PPIA и в 6,3 раза меньше для RPL4 по сравнению с RfxCas13d. 

Таким образом, разработанная платформа ΨДНК–Cas12 позволяет нацеливаться на РНК-мишени для редактирования «в обход» гидовых РНК. При этом она обеспечивает точность выше, чем РНК-зависимая нуклеаза Cas13. Авторы уже предлагают варианты практического применения ДНК-управляемого редактирования РНК. 

Нуклеаза Cas12a2 при активации разрывает геном клетки