Обнаружена маленькая и активная нуклеаза для редактирования генома человека

Системы CRISPR–Cas12f перспективны для редактирования генома, поскольку их нуклеазы компактны и совместимы с доставкой аденоассоциированным вирусным вектором (AAV). Однако эффективность редактирования в клетках млекопитающих ниже, чем у более крупных систем. Филогенетическое разнообразие Cas12f предполагает, что существует еще не исследованная возможность их оптимизировать. Авторы статьи в Nature Structural & Molecular Biology описали природный ортолог Cas12f, который обеспечивает эффективное редактирование генома в человеческих клетках. 

Нуклеазы Cas12f — это эффекторные белки систем CRISPR-Cas типа V. Чтобы охарактеризовать разнообразие этих систем, ученые проанализировали базу данных микробных метагеномов из различных средств обитания. Они обнаружили неохарактеризованные гены, которые кодировали небольшие нуклеазы и располагались в непосредственной близости от массивов CRISPR. Филогенетический анализ выявил сходство некоторых с нуклеазами Cas12f. 

Обнаруженные аминокислотные последовательности Cas12f-MG119-1, Cas12f-MG119-2, Cas12f-MG119-3 и Al3Cas12f имели длину от 433 до 488 остатков и 25–52% сходства с референсными Cas12f. 

Редактирующую активность Al3Cas12f — нуклеазы, обнаруженной у бактерии Alistipes sp. — ученые оценили на культуре клеток человека. Они сконструировали гидовые РНК (gRNA), нацеленные на гены ALB, APOA и участке AAVS1 в интроне PPP1R12C. Результаты скрининга выявили, что в 27 сайтах AAVS1 и APOA уровень редактирования был выше 10%, в 19 сайтах — выше 50%, а в 10 сайтах — выше 90%. 

Авторы также проверили, как различные длины спейсеров влияют на эффективность редактирования Al3Cas12f. Для многих сайтов оптимальной оказалась длина 19 нуклеотидов. 
Затем исследователи проанализировали структуру фермента с помощью криоэлектронной микроскопии. Они получили комплекс Al3Cas12f с гидовой РНК и подробно охарактеризовали его трехмерную структуру, а затем сравнили ее со структурами Cas12f других видов — Oscillibacter sp. и Ruminiclostridium herbifermentans (OsCas12f и RhCas12f соответственно). Для Al3Cas12f было характерно нахождение в виде стабильного димера, который, по-видимому, облегчает формирование R-петли — участка, где РНК (в данном случае гидовая) вытесняет одну из цепей ДНК в целевом сайте. Также ученые пришли к выводу, что у гидовых РНК Cas12f возможен широкий спектр структур, а у самих нуклеаз Cas12f, судя по разнообразию конформаций, встречаются различные механизмы расщепления. 

Кроме того, исследователи показали, что дистальный участок стебля 2 гидовой РНК не влияет на активность OsCas12f, но снижает ее у RhCas12f. По-видимому, модификации этого участка можно применять для оптимизации активности Cas12f. 

Несмотря на насыщающий уровень редактирования в AAVS1, в других локусах (например, SOD1) наблюдалась эффективность менее 61%. Чтобы повысить активность Al3Cas12f, ученые определили консервативные функциональные сайты в этом ферменте и внесли замены, чтобы увеличить положительный заряд остатков, находящихся на расстоянии водородной связи с субстратом ДНК и/или gRNA. Они выбрали шесть одиночных замен, которые обеспечивали эффективность редактирования более 60%, а затем получили двойные или тройные комбинации. Их, а также один вариант со всеми шестью заменами, протестировали на редактирующую активность; в качестве мишеней выбрали AAVS1 и SOD1. 

В общей сложности 21 из 35 комбинаторных вариантов обеспечили эффективность редактирования SOD1 не менее 75%, и только у гексамутанта она была ниже, чем у Al3Cas12f дикого типа. В качестве наиболее оптимального варианта ученые выбрали Al3Cas12f с тремя заменами — K79R, M190K и E222K (RKK). Его дополнительно протестировали с gRNA, оптимизированными для Al3Cas12f дикого типа, и для шести из восьми gRNA наблюдался уровень редактирования более 80%. 

Идентифицированный в работе природный ортолог Cas12f обладает высокой активностью в клетках человека. Он образует стабильные димеры, которые облегчают формирование R-петли в комплексе фермента с гидовой РНК и мишенью. Также для Al3Cas12f характерны высокая природная активность и разнообразие gRNA, а сам фермент обладает небольшим размером. Все это делает обнаруженную нуклеазу перспективным инструментом для редактирования генома. 

TIGR-Tas — компактная фаговая альтернатива CRISPR