Разработана миниатюрная CRISPR-система для редактирования генома млекопитающих

Одним из факторов, ограничивающих использование систем CRISPR-Cas9 или CRISPR-Cas12a для редактирования генома, является большой размер эффекторных белков, затрудняющий их доставку в клетки. Ученые из Стэнфордского университета сообщили в Molecular Cell о разработке миниатюрной CRISPR-системы на основе относительно небольшого белка Cas12f (Cas14). Новая система, получившая название CasMINI, по специфичности и эффективности не уступает более крупным системам.

Ключевой элемент CasMINI — модифицированный CRISPR-белок типа V-F Cas12f, также известный как Cas14. Этот белок состоит всего из 529 аминокислотных остатков. Природный вариант Cas12f практически неактивен в клетках млекопитающих. С помощью итеративной белковой инженерии (поэтапного улучшения) и скрининга итоговых вариантов белка авторы исследования получили новую версию Cas12f, которая подходит для редактирования генома и регуляции транскрипции в клетках млекопитающих. Кроме того, ученые оптимизировали процесс создания гидовой РНК.

Самые лучшие искусственные варианты Cas12f с инактивированной функцией разрезания ДНК (dCasMINI) сшивали с транскрипционным активатором VPR (VP64-P65AD-Rta). Так был получен компактный программируемый активатор транскрипции: гидовая РНК направляет комплекс dCas12f-VPR к регуляторной области гена-мишени, dCas12f связывается с ней, а VPR запускает транскрипцию.

Система работала и с репортерными, и с эндогенными генами. В экспериментах на клетках линии HEK293 ученые показали, что по эффективности активации генов и специфичности система dCasMINI-VPR не уступает аналогичной системе, основанной на Cas12a. Кроме того, инженерная dCasMINI, сшитая с редактором азотистых оснований, успешно превращала пары A-T в G-C в сайтах-мишенях.

Для оценки эффективности и специфичности редактирования генома с помощью системы с каталитически активной инженерной Cas12f (CasMINI) ученые попарно сравнили три самых удачных искусственных варианта CasMINI и Cas12f дикого типа. Мишенями для редактирования стали четыре точки в пределах гена, кодирующего эндотелиальный фактор роста сосудов VEGFA. Эффективность внесения вставок и делеций определяли с помощью глубокого секвенирования. Оказалось, что варианты CasMINI, оптимальные для редактирования генома, отличаются от таковых для активации транскрипции. Дальнейшие эксперименты показали, что делеции, вносимые CasMINI, больше, чем делеции, опосредованные Cas12f дикого типа и Cas9.

Авторы отмечают, что CasMINI, помимо своего размера, имеет еще одно преимущество. Поскольку исходный белок происходит от археи, а не от патогенной для человека бактерии, его иммунногенность должна быть минимальной.