«Маленький принц» для редактирования генома

Точный временной контроль над системами редактирования генома важен для их безопасного применения, однако такая регуляция остается сложной задачей. Контролируемого терапевтического редактирования in situ, которое сохраняло бы как точность, так и эффективность, еще не было получено. Авторы статьи в Science Translational Medicine разработали управляемую систему PRINCE, в которой и нуклеаза, и направляющие РНК индуцируются малыми молекулами. Ее компактная версия получила название Little Prince и показала хорошую надежность в двух мышиных моделях. 

Исследователи начали с системы CRISPR-Cas9 и исходно сосредоточились на точном контроле экспрессии нуклеазы. Для индукции они сшили Cas9 c модифицированным эстрогеновым рецептором Т2 (ERT2), который активируется 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT), но не эндогенным эстрогеном. Это обеспечивало лучший контроль, чем другие системы индукции, однако фоновый уровень экспрессии все еще оставался высоким. 

Не добившись достаточно точной регуляции за счет одной только нуклеазы, ученые предложили сделать индуцибельной еще и гидовую РНК. С этой целью они воспользовались тетрациклиновым оператором (TetO) — по умолчанию он связан с репрессором (TetR), который подавляет инициацию транскрипции, но репрессия снимается доксициклином. В присутствии конститутивно экспрессируемой Cas9 такая система обеспечивала заметную индукцию гидовых РНК доксициклином, хотя их фоновая экспрессия также оставалась заметной.

Тогда авторы скомбинировали индукцию Cas9 и ее гидовой РНК. Система, содержащая варианты Cas9-ERT2 и TetO-зависимые гидовые РНК, обеспечивала практически необнаружимую фоновую активность и эффективное редактирование в ответ на индукцию малыми молекулами. Разработка получила название PRINCE. 

Сперва разработку протестировали на клеточной линии HEK293T. Доставленные с помощью лентивирусов редактирующие конструкции, нацеленные на три локуса — AAVS1, CLTA и EMX1, — при индукции обеспечивали эффективность редактирования, сопоставимую с эффективностью конститутивно экспрессируемой CRISPR-Cas9. Индуцибельность и редактирующая активность сохранялись в клетках больше года. 

Авторы также адаптировали PRINCE для прайм-редактирования и протестировали его на двух других генах — хемокинового рецептора CCR5 и фермента идуронат-2-сульфатазы (IDS). Индукция усиливала редактирование в 67 и 38 раз соответственно. 

Однако система оказалась слишком крупной для аденоассоциированных вирусных векторов (AAV), которые применяют для доставки in vivo — для упаковки PRINCE потребовалось бы несколько AAV. Поэтому авторы сконструировали версию, совместимую с доставкой в одном AAV — она была основана на компактных нуклеазах, таких как OsCas12f1. Этой разработке дали название Little Prince. 

Подтвердив функциональность «маленького принца» на клеточных культурах, ученые протестировали эту систему на гуманизированных мышах. Они выбрали для опытов мышиную модель гиперхолестеринемии. В качестве мишени выбрали ген PCSK9, негативный регулятор рецептора ЛПНП (липопротеинов низкой плотности). Уже известно, что снижение его активности, например, за счет мутаций с потерей функции, может снижать концентрацию холестерина в сыворотке крови. Little Prince, нацеленную на человеческий PCSK9, упаковали в AAV серотипа 8 с тропизмом к печени, основного места экспрессии этого гена, и ввели в кровоток мышам. При введении индукторов система смягчала патологию у мышей с гиперхолестеринемией — уровень общего холестерина в сыворотке крови снижался на 45%, уровень ЛПНП на 47%. 

Другая патология, на которой авторы показали терапевтический потенциал Little Prince — это неоваскулярная возрастная дегенерация сетчатки. Ее также смоделировали на гуманизированных мышах. Мишенью в данном случае был фактор роста сосудистого эндотелия VEGFA. Ученые доставили Little Prince для этой мишени в сетчатку мышей, подтвердили экспрессию редактирующей системы и появление инделов в гене-мишени. Размеры поражений сетчатки были меньше, чем в контроле, а утечки контрастного вещества сокращались, что говорит о смягчении сосудистой патологии. 

Наконец, ученые сравнили нецелевую активность обеих систем — PRINCE и Little Prince — с таковой у конститутивно экспрессируемых редакторов. Вне зависимости от типа нуклеазы или гена-мишени, она была ниже у новых разработок как в клеточной культуре, так и в организме мыши. 

Авторы заключают, что разработанная ими система — как PRINCE, так и ее компактная версия — перспективна для терапевтического применения, поскольку обеспечивает возможность точно контролировать экспрессию редактирующей конструкции и обладает низкой нецелевой активностью. 


Новый инструмент для редактирования ДНК с высокой точностью вставляет в геном целые гены