TIGR-Tas — компактная фаговая альтернатива CRISPR

Механизмы, управляемые гидовыми РНК, обладают удивительной универсальностью и разнообразием биологических функций. Например, системы адаптивного иммунитета CRISPR-Cas, встречающиеся у бактерий и архей, распознают и расщепляют чужеродные ДНК или РНК. Это распознавание направляется гидовыми РНК, массив которых может обновляться в ответ на появление новых чужеродных последовательностей. Коллектив с участием Евгения Кунина и Фэна Чжана обнаружил и описал TIGR-Tas — аналогичную систему у фагов и паразитических бактерий.

Исследователи провели итеративный поиск гомологии структур и последовательностей, отправной точкой в котором стал домен распознавания гидовой РНК в составе Cas9. При этом обнаружилось обособленное семейство белков, содержащих домен Nop — он распознает РНК-белковые комплексы. Дальнейший анализ геномного контекста показал, что гены, кодирующие белки этого семейства, ассоциированы с длинными массивами чередующихся повторов.

На первый взгляд они напомнили ученым последовательности CRISPR, которые обычно состоят из коротких (25-36 нт) повторов, перемежающихся спейсерами аналогичного размера. Существенное отличие состояло в том, что обнаруженные в данном исследовании последовательности состояли из двух отдельных, чередующихся 8-12-нт повторов, перемежающихся 9-нт спейсерами (хотя были и исключения с спейсерами до 12 нт). В структуру каждого массива повторов входили краевые повторы, спейсер А, петлевой повтор и спейсер B. Такую систему авторы назвали направляющей РНК с перемежающимися повторами (Tandem Interspaced Guide RNA, TIGR), а ассоциированный с ней белок, содержащий Nop-домен, — TIGR-ассоциированным белком (Tas).

Tas-белок встречался в трех вариантах: он содержал только Nop-домен (этот вариант получил обозначение TasA) либо был слит с нуклеазными доменами HNH (TasH) или RuvC (TasR).

Затем исследователи показали, что последовательности TIGR служат для синтеза гидовых РНК длиной 36 нуклеотидов (тигРНК), которые направляют специфическое связывание ДНК с последовательностью через механизм тандемного спейсера. TasA, TasR и TasH и соответствующие TIGR экспрессировали в клетках Escherichia coli, после чего провели секвенирование связавшихся с Tas-белками молекул РНК. Анализ выявил, что все три Tas-белка связывали 36-нуклеотидные РНК, последовательность которых начиналась с середины краевого повтора, содержала спейсер A, петлевой повтор и спейсер B, а заканчивалась серединой второго краевого повтора.

При этом механизм нацеливания заметно отличался от систем CRISPR, где спейсер гидовой РНК должен быть комплементарен участку одной из цепей целевой ДНК. В данном случае спейсер А оказывался комплементарен одной нити мишени, а спейсер B — второй, то есть они действовали в тандеме. Кроме того, система не зависела от прилегающих к протоспейсеру мотивов (PAM), необходимых для работы CRISPR-Cas.

Ученые также проанализировали комплекс тигРНК с Tas-белком и ДНК-мишенью, охарактеризовав структуру с помощью криоэлектронной микроскопии. Структурно TasR имел высокую степень сходства с транспозазами IS110 (они также направляются с помощью РНК) и компонентами малых ядрышковых рибонуклеопротеинов, участвующих в созревании рибосомальных РНК. По результатам анализа они предположили, что для созревания тигРНК необходимо наличие функционального TasR.

Открытие РНК-нацеливаемых систем распознавания и редактирования ДНК ценно как для фундаментальной, так и для прикладной биологии. Обнаружение TIGR-Tas расширяет известное разнообразие клеточных механизмов, а дальнейший анализ ее сходства с уже известными системами нацеливания позволит узнать больше про эволюцию РНК-управляемых систем. Нуклеазу TasR можно перепрограммировать для направленного расщепления ДНК, и такое редактирование можно будет осуществлять в том числе в клетках человека. «Благодаря тому, что эта система завязана на гидовых РНК, ее должно быть относительно несложно перепрограммировать, ведь мы знаем, как РНК связывается с другими ДНК или РНК», — объясняет Фэн Чжан, последний автор опубликованной в Science статьи. Кроме того, белки Tas более компактны (в среднем, они вчетверо меньше Cas9), что упростит их доставку и позволит преодолеть основное препятствие в терапевтическом редактировании генов.

Обнаружены новые ферменты, защищающие прокариот от вирусов