Мыши, беременные светящимися мышатами, помогут исследовать циркадные часы млекопитающих

Исследователи из Вашингтонского университета в Сент-Луисе (США) провели изящный эксперимент. Они получили обычных мышей, вынашивающих эмбрионов, которые экспрессировали ген циркадного ритма PER2, слитый с люциферазой, и регистрировали колебания интенсивности свечения внутри мыши-матери.

Циркадные (околосуточные) ритмы у млекопитающих регулируются на разных уровнях. В отдельных клетках регуляцию обеспечивает петля обратной связи экспрессии определенных генов. Гетеродимерный фактор транскрипции CLOCK:BMAL1 усиливает экспрессию многих генов, управляющих суточными ритмами. Продукты двух из них — белок Period (гены PER1, 2 и 3) и криптохром (ген CRY1 и 2) — репрессируют экспрессию самих белков CLOCK и BMAL1. Когда количество PER и CRY снижается, CLOCK и BMAL1 снова начинают вырабатываться, и околосуточный цикл начинается заново. У взрослых супрахиазматическое ядро (СХЯ) в гипоталамусе генерирует ритмы продолжительностью около 24 часов, синхронизируясь с внешними сигналами, такими как колебания света, и регулирует ритмы во всем организме. Гены PER тоже участвуют в синхронизации ритма со световой периодичностью.

Суточные ритмы в генах циркадных часов не обнаруживаются в эмбриональных стволовых клетках или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПСК). Более того, ритмичность исчезает в клетках, которые прошли дифференцировку, но были дедифференцированы в состояние иПСК. В различных тканях плода мыши — клетках печени, почек — циркадные ритмы регистрировали уже на 13-й день эмбрионального развития (беременность у мыши длится 19–20 дней). — при этом в СХЯ плода на этом сроке ритмы еще не прослеживаются. Они начинают появляться днем позже, и на 15-й день почти все клетки СХЯ зародыша уже демонстрируют синхронизированные суточные ритмы. Возникает вопрос: какие факторы (скорее всего, материнские) влияют на запуск циркадных часов животного?

Традиционные подходы требовали умерщвления мышей, и получить данные о разных этапах процесса можно было только объединяя данные от многих особей. Авторы новой работы придумали способ, позволяющий наблюдать экспрессию гена циркадного ритма в эмбрионе мыши в реальном времени, прямо внутри матери.

Самок обычных лабораторных мышей содержали в условиях 12-часового светового дня и 12-часового затемнения. Их скрещивали с генно-модифицированными самцами, в организме которых экспрессировался белок PER2, слитый с люциферазой, — PER2::LUC. Таким образом, в организме несветящейся матери росли светящиеся эмбрионы, причем интенсивность биолюминесценции отражала экспрессию ключевого белка циркадного ритма. Люциферин — субстрат люциферазы, необходимый для свечения, — мыши получали с питьевой водой (этот вариант был более щадящим и способствовал более успешному вынашиванию беременности), либо люциферин вводили внутрибрюшинно.

Во время наблюдений мышам удаляли шерсть с живота кремом-депилятором. Их содержали в светонепроницаемых боксах, а свечение внутри свободно перемещавшейся мыши регистрировали с помощью фотоумножителей. Регистрацию вели с 14 по 19-й день беременности. Всего наблюдали шесть самок, у каждой из которых было от 4 до 9 детенышей. В другой группе самок анестезировали и проводили более детальную визуализацию каждые 12 часов с 8-го до 14-го дня, а далее каждые 4 часа.

У небеременных взрослых самок с той же генной модификацией, что у плодов, пик свечения приходился на «сумерки» (время, близкое к моменту выключения света, если бы поддерживался тот же световой цикл). Биолюминесценция плода и плаценты постепенно нарастала на протяжении беременности. Примерно на 14-15-й дни начинал прослеживаться циркадный ритм экспрессии PER2, также с пиком в «сумерках».

Ранее было показано, что глюкокортикоиды (стероидные гормоны коры надпочечников, или их синтетические аналоги, например, дексаметазон) могут действовать как синхронизирующий сигнал на СХЯ плода. У матерей-мышей уровень глюкокортикоидов обычно тоже достигает пика в сумерках, поэтому авторы предположили, что инъекции глюкокортикоида могут сдвигать цикл экспрессии PER2::LUC у плодов, а также синхронизировать ритмы отдельных плодов одной матери. Действительно, такие эффекты удалось наблюдать.

В ряде экспериментов in vitro авторы подтвердили, что фетальный и материнский слои плаценты изменяют свои циркадные ритмы при воздействии глюкокортикоида, причем ритмы материнского слоя участвовали в суточной координации работы плаценты. В то же время добавление in vitro антагониста глюкокортикоидных рецепторов мифепристона нарушало синхронность.

Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что фетальные циркадные ритмы, формируясь во время беременности, синхронизируются с ритмами матери при участии глюкокортикоидной сигнализации. Они указывают на необходимость дальнейших исследований введения дексаметазона в определенное время. (Его назначают беременным с риском преждевременных родов, чтобы способствовать созреванию легких у плода.)

Авторы также обращают внимание на то, что нарушение развития циркадного ритма у плода было связано с неудачными беременностями. Аналогичная связь известна для факторов, нарушающих циркадные ритмы матери, таких как сменная работа или постоянное освещение.)

Разрушение кости имеет устойчивый циркадный ритм с пиком в 3 часа ночи