Нокаут единственного гена вызывает у мышей признаки расстройства аутистического спектра

Астротактин 2 (ASTN2) — это гликопротеин, который экспрессируется в нейронах позвоночных и участвует в переносе белков, в том числе синаптических рецепторов, а также астротактина 1, необходимого для миграции нейронов при формировании мозга. Экспрессия ASTN2 особенно высока в мозжечке, а вариации числа копий гена ASTN2 ассоциированы с риском развития расстройств аутистического спектра (РАС). Еще в 2018 году группа ученых из США опубликовала исследование о семье, в которой по отцовской линии наследовалась дупликация ASTN2. В этой семье встречались различные расстройства развития центральной нервной системы, в том числе РАС, задержки в умственном развитии и т.д. В новой работе та же группа ученых продолжает изучать роль ASTN2 в мозге, а также при развитии РАС.

Исследователи получили мышей с полным нокаутом гена Astn2, а также с условным нокаутом этого же гена только в клетках Пуркинье — тормозных нейронах мозжечка. Для этого ученые с помощью CRISPR/Cas9 удалили первый экзон и промоторный участок гена Astn2. Чтобы сделать условный нокаут, использовали технологию Cre-Lox рекомбинации.

Далее авторы оценивали действия мышей с полным нокаутом ASTN2 в поведенческих тестах. Один из признаков РАС в мышиных моделях — это поведение детенышей при их отлучении от матери. В норме мышата начинают издавать звуки, в то время как мышата с РАС менее склонны к этому. Действительно, детеныши с нокаутом Astn2 издавали более короткие звуки и в меньшем диапазоне частот по сравнению с контрольной группой животных, что указывает на нарушения социальной коммуникации.

Также для оценки социального поведения мышей помещали в комнату с тремя камерами. Сначала им давали привыкнуть к пустым камерам, а затем в одну камеру помещали новую мышь (социальный стимул) либо блок Лего (несоциальный стимул). В норме мыши предпочитают «знакомиться» со своими сородичами. В этом аспекте мыши с нокаутом Astn2 не отличались от контрольной группы, в основном предпочитая социальный стимул, но все равно проводили с другой мышью меньше времени. Однако в следующей фазе эксперимента в одну камеру помещали уже знакомую мышь, а в другую — новую. Мыши дикого типа предпочитают проводить больше времени с новой мышью, в то время как мыши с нокаутом Astn2, напротив, не имели таких предпочтений.

Поведение мышей также изучали в тесте с открытой ареной, где мыши могли свободно перемещаться. Расстояние, которое проходили мыши с нокаутом Astn2, было на треть больше по сравнению с контрольными мышами, что свидетельствовало об их гиперактивности. Также эти животные были склонны к повторяющимся движениям: вставали на задние лапы, кружились на одном месте. И гиперактивность, и повторяющиеся движения характерны для РАС.

Тест в открытом поле также позволил оценить уровень тревожности животных: если они больше времени проводят у стен арены, но не выходят в центр, то они испытывают повышенную тревогу. По сравнению с контролем мыши с нокаутом Astn2, напротив, больше времени проводили в центре арены. Дополнительно об уровне тревожности можно судить, когда арену частично накрывали коробкой, чтобы создать в ней тень. Если мыши больше времени проводят в тени или тратят много времени на то, чтобы перейти в освещенную часть арены, то они испытывают тревожность и проявляют избегающее поведение. Мыши с нокаутом Astn2 не имели каких-то предпочтений к уровню освещения, но при этом меньше сомневались при переходе из темной части арены в светлую по сравнению с контролями. Таким образом, эти животные имели сниженную тревогу.

Так как ASTN2 в основном экспрессируется в мозжечке, далее исследователи сосредоточились на этом отделе мозга. Известно, что мозжечок вовлечен в развитие РАС. В эксперименте ученые оценивали способность мышей к ассоциативному обучению, которое опосредуется мозжечком. Для этого у них вырабатывали условный рефлекс. Сначала мыши получали световой сигнал, потом им в мордочку дули воздухом, чтобы заставить их моргать. По мере обучения у мышей вырабатывался условный рефлекс, так что при световом сигнале они начинали моргать даже при отсутствии дуновения воздуха. Оказалось, что 5 из 9 животных с нокаутом Astn2 не выработали такого условного рефлекса, что указало на нарушения в работе мозжечка.

Мозжечок также ответственен за координацию движений и поддержание равновесия, поэтому исследователи проверили, влияет ли нокаут гена Astn2 на моторные функции. Детенышей переворачивали на спину, чтобы они снова встали на все лапы самостоятельно. И контрольные мышата, и животные с нокаутом Astn2 успешно справлялись с этой задачей. Нокаут Astn2 не повлиял и на равновесие: обе группы животных успешно удерживались на вращающемся барабане, причем мыши с нокаутом справлялись даже лучше.

При условном нокауте Astn2 только в клетках Пуркинье сохранялись некоторые из проявлений, характерных для РАС. Такие мыши тоже были гиперактивными и склонными к повторяющимся движениям в тесте с открытой ареной, но при этом у них не было социальных дефицитов.

Влияние нокаута Astn2 оценили также на клеточном уровне, определив число дендритных шипиков — выростов на мембране дендритов нейронов, которые способны образовать синапсы. В особенности ученых интересовало число незрелых нитевидных шипиков. В задней части мозжечка при нокауте Astn2 повышалось общее число шипиков, но встречалось меньше длинных незрелых шипиков. Исследователи заключили, что даже малейшие нарушения на уровне синапсов могут приводить к изменению поведения.

Проведя протеомный анализ, ученые также обнаружили, что при нокауте Astn2 повышается уровень астротактина 1, хотя на уровне мРНК его экспрессия не меняется. Повышение концентрации астротактина 1 ученые связали с отсутствием ASTN2, который участвует в его переносе и деградации. Так как астротактин 1 важен для коммуникации между нейронами и глией, особенно во время развития мозга, ученые оценили уровень взаимодействия между клетками Пуркинье и радиальной глией. При нокауте Astn2 повышалось количество радиальной глии, что также может влиять на поведение животных.

Исследователи планируют продолжить изучать роль ASTN2 в развитии мозга и РАС, используя клетки мозжечка человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток. В том числе они намерены использовать в экспериментах клетки с мутациями ASTN2, которые были получены от доноров.

Разработана модель для диагностики РАС по микробиому кишечника