Новый биосенсор позволил отследить динамику нейромедиатора в мозге мышей

Орексины — это нейромедиаторы пептидной природы, которые синтезируются исключительно в клетках латеральной зоны гипоталамуса. Их секреция связана с регуляцией эмоционального возбуждения человека, системой вознаграждения и принятием решений. Исследователи из Института фармакологии и токсикологии Цюриха создали генетически кодируемый сенсор, который позволил проследить динамику взаимодействия орексина с рецептором in vivo.

Для создания сенсора ученые применили широко известный метод мутагенеза зеленого флуоресцентного белка GFP. В результате генетических манипуляций прежние N- и C-концы белка лигируются, а новые образуются в другом месте. При этом вторичная структура белка не нарушается. Такой подход позволяет получить более подвижный флуоресцентный белок cpGFP, реагирующий на конформационные изменения. Соединив cpGFP с рецептором орексина, исследователи получили сенсор OxLight1, флуоресцирующий при активации нейромедиатором. В качестве отрицательного контроля они использовали конструкцию с мутациями в сайте связывания, которая не флуоресцировала в присутствии орексина.

В культуре нейронов сенсор демонстрировал исключительную специфичность к орексину и детектировал его концентрацию в пределах физиологической нормы. Флуоресценция OxLight1 была стабильна в течение 1,5 часа после активации и могла быть выключена с помощью антагонистов орексина. Более того, связывание нейромедиатора не приводило к активации нижележащих сигнальных путей и вмешательству в метаболизм клетки.

Подтвердив работу своего сенсора in vivo на мышах, исследователи проследили его динамику во время физической активности и циклов засыпания-пробуждения. Для наблюдений в мозг мыши вживляли оптоволокно. Уровень флуоресценции OxLight1 возрастал в течение 500 мс после начала бега, а максимальная амплитуда коррелирует со скоростью движения мыши. (В этом эксперименте животные с зафиксированной головой бежали по вращающемуся кругу.) Сенсор также флуоресцировал при поднятии мыши за хвост, что говорило о секреции орексина при аверсивных (неприятных для животного) стимулах.

Изучив данные электроэнцефалографии и электромиографии параллельно с использованием OxLight1, исследователи проанализировали активность орексиновых нейронов во время сна и бодрствования. Активное высвобождение орексина наблюдали, когда животное бодрствовало, а также во время фазы медленного сна. Введение снотворного препарата суворексанта, действующего на орексиновые рецепторы, приводило к понижению сигнала от OxLight1. Кроме того исследователи подтвердили, что разные типы анестетиков имеют различные механизмы действия — изофлуран, в отличие от медетомидина, действовал как антагонист орексина и приводил к снижению сигнала OxLight1.

По данным ученых, их сенсор может использоваться в двухфотонной флуоресцентной микроскопии. В числе ее преимуществ — более точный фокус и возможность использования инфракрасного излучения, которое лучше проникает через биологические ткани. С помощью данного метода авторы изучили динамику орексина в коре головного мозга при пробуждении от наркоза. Через минуту после прекращения подачи изофлурана флуоресценция сенсора в зрительной коре начала возрастать и достигла плато через 4 минуты. При более детальном анализе обнаружилось, что в зрительной коре существуют стабильные области с низкой и высокой активностью OxLight1. Статистический анализ выявил корреляцию между высокоактивными областями на стадии нарастании флуоресцентного сигнала.

Ученые планируют и дальше использовать свой биосенсор в изучении процессов, протекающих в мозге. Как сообщил руководитель исследования Томмазо Патриархи, они уже применяют OxLight1 для исследования нарколепсии и развития зависимостей.