Новый способ получения зрелых кардиомиоцитов in vitro

Одна из проблем, с которой сталкиваются ученые, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), заключается в «молодости» полученных после дифференцировки клеток. Так, незрелые кардиомиоциты не могут дать полной информации о том, что же будет происходить со зрелыми клетками в тех или иных условиях. Имеющиеся же на данный момент методы «воспитания» с использованием электростимуляции или 3D-культивирования требуют много времени, денег и труда. Группа исследователей из США нашла новый способ досрочного созревания кардиомиоцитов, полученных из ИПСК (ИПСК-КМ).

Для оценки зрелости кардиомиоцитов учитывают целый набор параметров: замедление пролиферации, увеличение количества ядер и размеров клеток, переход от гликолиза к окислительному фосфорилированию. Также в ходе развития организма происходит изменение паттерна экспрессии миозина разных изоформ, а медленный скелетный тропонин I в кардиомиоцитах постепенно заменяется кардиотропонином I.

Сперва ученые сравнили имеющиеся данные по транскриптому и эпигеному ИПСК-КМ, и образцов тканей сердца от людей разного возраста. Биоинформатический анализ показал, что по экспрессионному профилю ИПСК-КМ ближе к клеткам плода, чем взрослого организма.

Исследователи выделили три кластера дифференциально экспрессируемых генов в зависимости от возраста образцов и отметили сигнальные пути, которые чаще всего затрагиваются генами этих кластеров. Так было решено сконцентрироваться на роли MAPK и PI3K-AKT в созревании кардиомиоцитов. Ученые применили ингибиторы белков p38, PDK1 и MEK1/2 (малые молекулы SB203580 и PD0325901).

Данные проточной цитофлуориметрии, иммунофлуоресцентного анализа и вестерн-блота помогли отследить изменения экспрессии тропонинов и изоформ миозина под действием выбранных ингибиторов. Оценивая экспрессию Ki-67, ученые отметили снижение пролиферации кардиомиоцитов. Клетки также увеличились в размерах, став при этом более вытянутыми, и приобрели большее количество ядер. Ранее другими учеными было показано, что низкие уровни ECT2 и GAS2L3 влияют на цитокинез и приводят к мультинуклеарности. Исследователи отметили сниженную экспрессию данных белков.

Клетки в целом стали более метаболически активными. Возросла плотность Т-трубочек, что повлекло и изменения в работе ИПСК-КМ с кальцием. Далее последовали повышение гиперполяризации потенциала покоя мембраны и усиление потоков ионов натрия. Трансмиссионная электронная микроскопия помогла увидеть изменения в ультраструктуре митохондрий, а стресс-тесты — оценить поглощение кислорода. Исследователи отметили снижение гликолиза и повышение уровня окислительного фосфорилирования после обработки ингибиторами 30-дневных ИПСК-КМ. В целом клетки приобрели характеристики 60-дневных необработанных клеток или даже более зрелых.

Так как манипулирование сигнальными путями MAPK/PI3K/AKT может повлиять на выживание клеток, ученые проверили, не изменилась ли и эта характеристика. Они не нашли признаков повышения уровня апоптоза или изменения экспрессии проапоптотических генов после использования выбранной дозы ингибиторов в течение пяти дней.

Полученные данные показывают, что работа MAPK/PI3K/AKT значительно влияет на созревание кардиомиоцитов. По мнению авторов, использование малых молекул для манипулирования этими сигнальными путями может стать удобным и эффективным способом для получения зрелых ИПСК-КМ.