Обнаружен ключевой фактор активации генома зиготы у мышей

Развитие многоклеточных животных начинается с оплодотворенной яйцеклетки и сначала регулируется материнскими мРНК, которые сохраняются в цитоплазме. Активация генома зиготы (zygotic genome activation, ZGA) — включение транскрипции генов зародыша — происходит вскоре после оплодотворения, когда зародыш состоит из нескольких клеток. В этом процессе участвуют цитоплазматические факторы. Механизмы активации не консервативны у разных таксонов и мало изучены у млекопитающих. У мышей активация эмбрионального генома происходит в два этапа: первый на стадии зиготы, второй — в двухклеточных эмбрионах. Для активации экспрессии транскрипционный фактор связывается с регуляторными последовательностями в геноме. Этому взаимодействию может препятствовать плотная упаковка хроматина. Однако существуют так называемые пионерные транскрипционные факторы, способны связывать нуклеосомную ДНК, которая намотана на октамер из гистоновых белков, и влиять на упаковку хроматина, запуская активацию генов зародыша. Действие пионерных факторов было показано у дрозофилы и рыбки данио, но не у млекопитающих.

Ученые из Института биохимии Макса Планка и Института молекулярной биотехнологии Академии наук Австрии исследовали активацию генов зиготы в двухклеточных эмбрионах мыши. Они сравнили транскрипционные профили в эмбрионах двух линий мышей и нашли 985 генов, экспрессия которых резко возрастала на этой стадии у обеих линий; можно сделать вывод, что это основные (ко́ровые) гены ZGA. Поиск транскрипционных мотивов de novo выявил консенсусную последовательность, которая присутствует вблизи 70% генов ZGA (а возле других генов — лишь в 30% случаев). Она имеет сходство с ретротранспозонами семейства SINE B1 (оно родственно семейству Alu-повторов человеческого генома) и включает вариабельные пурин/пиримидиновые участки YR5. 

YR5 является частью мотива 1, который содержит консенсусные последовательности, распознаваемые ядерными рецепторами Nr5a2и Esrrb. С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток авторы проанализировали активность генов Esrrb и Nr5a2 после оплодотворения. Esrrb экспрессировался только на стадии двухклеточного эмбриона, а Nr5a2, помимо этого, в ооцитах и оплодотворенных яйцеклетках.

Для подтверждения роли гена Nr5a2 в эмбриональной активации авторы инкубировали зиготы через 6 часов после оплодотворения, а также двухклеточные эмбрионы с SR1848, селективным ингибитором Nr5a2. Зиготы в присутствии ингибитора не образовывали бластоцисты и подвергались фрагментированию, а двухклеточные эмбрионы останавливались в развитии.

Чтобы наблюдать активацию эмбрионального генома напрямую, авторы изготовили РНК-зонды для FISH-гибридизации, которые детектировали около 80 транскриптов генов ZGA. Инкубация двухклеточных эмбрионов с ингибитором SR1848 снижала уровень этих транскриптов. Последующие микроинъекции мРНК, кодирующей Nr5a2, восстанавливали уровень экспрессии генов ZGA. Стоит отметить, что мРНК Esrrb не имела эффекта.

Чтобы получить еще одно подтверждение роли белка Nr5a2 в ZGA, был использован метод Trim-Away, который позволяет провести специфичную деградацию белка. В результате авторы наблюдали снижение уровня транскриптов генов ZGA. Нокдаун гена Nr5a2 с помощью интерферирующей РНК также снизил экспрессию генов ZGA на 27% в двухклеточных эмбрионах, нокдаун Esrrb приводил к снижению на 18%.

Анализ профилей взаимодействия Nr5a2 и Esrrb с геномом, выполненный методом CUT&Tag, показал, что мотивы содержат консенсусные последовательности, которые перекрываются с последовательностями ретротранспозонов SINE B1. Можно предположить, что большинство мотивов Nr5a2 происходят от размножения SINE B1 в геноме. Также анализ подтвердил, что участки связывания Nr5a2 расположены близко к генам ZGA.

Сравнение полученных профилей связывания и ранее опубликованных данных ATAC-seq и ChIP-seq позволили авторам определить, что Nr5a2 и Esrrb преимущественно связываются с последовательностями специфичных энхансеров на разных стадиях эмбионального развития.

Для изучения доступности хроматина авторы разработали метод ChARM (количественное определения открытого хроматина посредством микроскопии). После нокдауна или ингибирования Nr5a2 и Esrrb  в областях начала транскрипции генов ZGA доступность хроматина снижалась.

Методом SeEN-seq (Selected Engagement on Nucleosome sequencing) авторы продемонстрировали, что Nr5a2 и Esrrb распознают свой мотив даже в суперспиральных положениях. Таким образом, Nr5a2 и Esrrb действительно являются пионерными транскрипционными факторами и играют ключевую роль при ZGA.

Ученые предполагают, что материнский Nr5a2 в цитоплазме яйцеклетки — основной ядерный рецептор, необходимый для активации эмбрионального генома. Он связывается с SINE B1-элементами в регуляторными областями генов ZGA и тем самым влияет на их экспрессию. Интересно, что он регулирует и экспрессию собственного гена, а также экспрессию генов других ядерных рецепторов, активирующих гены на ранних стадиях эмбрионального развития. Таким образом, именно Nr5a2 запускает весь каскад взаимодействий транскрипционных факторов для активации эмбрионального генома.