Оптимизация нетранслируемых областей повысит эффективность мРНК-вакцины

Вакцины на основе матричной РНК (мРНК) рассматриваются как перспективный вариант для вакцинации большого количества людей во время эпидемии COVID-19. В силу высокой скорости разработки и изготовления они первыми попадают в клинические испытания. Чтобы вакцина была эффективной, мРНК белка-антигена должна активно транслироваться в клетках организма. На это влияют все компоненты мРНК: 5’-кэп, 3’-поли(А)-хвост, собственно последовательность антигена, а также последовательности 5’- и 3’-нетранслируемых областей (untranslated regions, UTR). На последних и сосредоточено исследование, опубликованное 5 апреля на bioRxiv.

Группа ученых из Университета штата Огайо (США) под руководством Ичжоу Дуна несколько лет работает над оптимизацией структуры и доставки мРНК в клетки и ткани. Целью новой работы стала оптимизация экспрессии мРНК, кодирующей потенциальные антигены SARS-CoV-2: S-белок, его рецептор-связывающий домен (RBD), а также белки N (нуклеокапсид), M (мембранный белок) и E (белок оболочки).

Сначала авторы занялись поиском оптимальных UTR среди естественных последовательностей. Для этого они провели биоинформатический анализ данных об уровне экпрессии и полупериоде жизни 4 248 мРНК млекопитающих и выяснили, что наивысшим уровнем экпрессии обладает мРНК гена Rsp27a, кодирующего белок малой субъединицы рибосомы. Последовательность ее 5’UTR оптимизировали, исключив олигопиримидиновый терминальный мотив, который может негативно влиять на трансляцию. Ученые протестировали полученную в результате последовательность S27a-44’, подшив ее к гену люциферазы светлячка. S27a-44’ повышала уровень трансляции люциферазы в культурах человеческих клеток эффективнее, чем естественные 5’UTR, обычно применяемые для подобных целей.

Последовательность 3’UTR гена Rsp27a (S27a) не уступала известным последовательностям в положительном воздействии на трансляцию люциферазы, но была короче остальных. Поэтому ученые выбрали именно 3’UTR S27a для дальнейших экспериментов.

Помимо оптимизации естественных последовательностей ученые применили и другой подход: конструирование 5’UTR de novo с использованием компьютерных алгоритмов. Так, с помощью инструмента AntaRNA они создали искусственный 5’UTR, учитывая, что в нем не должно быть шпильки и дополнительных мотивов AUG. Для оценки и минимизации третичной структуры авторы применили инструмент RNAfold.

Выяснилось, что 70 нуклеотидов — оптимальная длина для 5’UTR. Наибольшую эффективность показали две последовательности с минимальным содержанием GC и максимальным содержанием U. Из них убрали сайты узнавания miРНК, распознанные с помощью инструмента из базы данных miRDB, и в результате получили искусственный 5’UTR (NCA-7d).

Последовательность 3’UTR S27a оптимизировали, добавив к ней мотив R3U. Этот мотив распознается РНК-связывающим белком, в результате чего формируется рибонуклеопротеидный комплекс, повышающий эффективность трансляции. В итоге самой действенной комбинацией 5’ и 3’UTR была признана 5’ NCA-7d + (3’ S27a + R3U), получившая название NASAR.

Авторы также повысили эффективность доставки мРНК в клетки, заключив конструкцию в липидные наночастицы TT3, разработанные ими ранее. Использование TT3 повышало уровень экспрессии люциферазы и вирусных антигенов под контролем NASAR в культурах человеческих клеток.

При инъекции TT3-NASAR в мышцы задних конечностей мышей мРНК люциферазы экспрессировалась в 4,2 раза сильнее по сравнению с контрольной последовательностью. Кроме того, TT3 способствовали в 70 раз более эффективной экспрессии люциферазы, чем наночастицы MC3, одобренные FDA для доставки лекарственных препаратов. В мышечной ткани мышей, получивших TT3-NASAR с мРНК SARS-CoV-2, с помощью иммуноокрашивания была подтверждена экспрессия антигенов. Это говорит о том, что предложенный подход перспективен для разработки вакцины.

Попытки измененения некодирующих областей матричной РНК для увеличения экспрессии белка предпринимались и ранее, однако закономерности влияния UTR на скорость трансляции различных белков могут варьировать.