Оптофлюидный нанопоровый чип выявляет РНК вирусов без амплификации и мечения

Пандемия COVID-19 сделала очевидной важность экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и в то же время показала, что это задача может быть решена. Однако существующие методы молекулярной диагностики имеют хорошо известные ограничения. Например, классические ПЦР-тесты могут проводиться только в лабораторных условиях и требуют высокой квалификации персонала. Более простыми в использовании могут быть тесты на основе изотермической амплификации, однако они все же требуют обратной транскрипции и амплификации. Привлекательны методы, основанные на детекции единичных молекул, например, с использованием детекции флуоресценции и микрофлюидики. Но пока еще не появилось подхода, которые сочетал бы простоту с высокой чувствительностью.

Большой интерес представляют нанопоровые методы, в которых детектируется характерное изменение тока в растворе при прохождении молекулы аналита через пору в мембране. На этом основаны коммерческие технологии нанопорового секвенирования. Замечательно то, что молекулы детектируются напрямую (без обратной транскрипции в случае РНК), и чувствительность теоретически может быть на уровне единичных молекул. Однако при анализе биологических жидкостей сложного состава это скорее минус, и требуются подходы, повышающие количество молекулы-мишени в нанопоре. Кроме того, анализируются только молекулы, которые находятся в небольшом объеме раствора вокруг поры. При низких концентрациях аналита (например, фемтомолярных и аттомолярных, которые, однако, могут быть клинически значимы) это сводит на нет преимущества нанопора.

Авторы статьи ранее сконструировали оптофлюидные чипы, в которых эффективность нанопоровой детекции существенно повышается. Целевые нуклеиновые кислоты (в данном случае вирусные РНК) осаждаются на магнитных частицах, которые затем помещаются на чип. Оптический импульс направляет их в камеру с нанопорой, таким образом, аналит оказывается в объеме, которых охватывает электрическое поле нанопоры. Эту концепцию назвали TACRE — trapping-assisted capture rate enhancement. Ее испытали на синтетических олигомерах и РНК коронавируса SARS-CoV-2 в назальных мазках.

В новом исследовании авторы существенно повысили сложность. Образцы брали от мармозеток, инфицированных вирусом Зика (семя, моча, кровь), и бабуинов, инфицированных SARS-CoV-2 (мазки из носоглотки и зева, ректальные мазки, бронхоальвеолярный лаваж). Из всех образцов выделяли РНК; вирусные РНК осаждали на магнитных наночастицах, несущих специфические комплементарные олигонуклеотиды. Мониторинг проводился в течение четырех недель, образцы анализировали как с помощью ОТ-ПЦР, так и на чипах TACRE.

Чипы выявляли инфекцию во всех типах образцов с пределом обнаружения 10 аМ и динамическим диапазоном около пяти порядков. Это дает возможность следить за течением инфекции в режиме реального времени, наблюдать за динамикой вирусной нагрузки в биожидкостях. Результаты, полученные с помощью TACRE, хорошо согласовывались с результатами ОТ-ПЦР, более того, они позволили определить вирусную нагрузку для нескольких образцов, в которых результат ПЦР-теста был отрицательным.

Авторы надеются, что оптофлюидное нанопоровое тестирование может стать основой для нового подхода к клинической диагностике, а также применяться в качестве исследовательского инструмента. Результаты позволяют говорить о низкой либо средней сложности тестирования при аналитических характеристиках, сопоставимых с «золотым стандартом» ОТ-ПЦР. Для экстракции тотальной РНК можно использовать легкий и портативный сепарационный диск, подчеркивают авторы. Кроме того, есть возможность уменьшить объемы образцов и сделать анализ мультиплексным. 

Создан сверхчувствительный биосенсор для ранней диагностики рака молочной железы