Полиуретан, содержащий бактериальные споры, быстро разлагается в компосте

Живые клетки — привлекательная добавка для полимеров, потому что они могут размножаться, саморегулироваться и отвечать на различные стимулы. Такая добавка может не только улучшить свойства полимера, но и способствовать его биоразлагаемости. Однако живые клетки требовательны к параметрам среды, в том числе к влаге, осмотическому давлению, температуре и pH. В то же время для производства и обработки полимеров часто требуется нагрев, механическое напряжение, едкие растворители. Международная группа ученых предложила добавлять в пластик бактериальные споры, которые, как известно, устойчивы к экстремальным условиям и даже к радиации.

В качестве продуцента спор исследователи выбрали сенную палочку — Bacillus subtilis, которая относительно безопасна для человека и может разлагать полиэфирные полимеры. Чтобы повысить устойчивость спор к высоким температурам, исследователи провели лабораторную адаптивную эволюцию. Полученные споры, устойчивые к тепловому шоку, поместили в термопластичный полиуретан — полиэфирный пластик, который сейчас практически не перерабатывается. Далее исследователи оценили влияние спор на механические свойства полиуретана, а также показали, что такой пластик может быстро разлагаться в компосте.

Авторы работы использовали штамм B. subtilis ATCC 6633, потому что он наиболее активно рос в присутствии полиуретанового порошка. Он также оказался достаточно устойчивым к тепловому шоку: в условиях сухого жара споры переносили температуру выше 120℃, а в присутствии влаги — около 100℃. При этом после тепловой обработки в течение минуты выживало всего 25% спор, а через три минуты — только 3,3%. Такая устойчивость оказалась недостаточной, так как для производства термопластичного полиуретана используют экструзию горячего расплава, при которой достигаются даже более высокие температуры.

Чтобы повысить устойчивость спор к тепловому шоку, ученые провели эксперименты по лабораторной адаптивной эволюции. Выращенные споры помещали в кипящую воду, а затем переносили в питательную среду. Сначала споры выдерживали в кипящей воде всего 3 минуты, причем погибало больше 90% спор, однако через 40 циклов экспериментов споры могли перенести даже полчаса в кипящей воде. Всего было получено шесть устойчивых к тепловому шоку линий.

С помощью полногеномного секвенирования исследователи установили, какие мутации появились в устойчивых линиях B. subtilis. Чаще всего встречались мутации в генах fusA и abrB. Ген fusA кодирует фактор элонгации трансляции, а ген abrB — регулятор транскрипции, который управляет спорообразованием и ответом на стресс. Также в единичных случаях встречались мутации в генах walH и walK, которые находятся в одном опероне и, вероятно, как-то задействованы в ответе на тепловой шок. Наличие одной мутации в fusA увеличивало устойчивость к высоким температурам в три раза, а если при этом присутствовала мутация в abrB, то устойчивость повышалась в 4,5–17,7 раз в зависимости от типа мутации в fusA.

Далее лиофилизированные споры (дикого типа и устойчивые к тепловому шоку) добавляли к гранулам полиуретана в количестве до 1 масс.%. В ходе получения биокомпозита смесь должна была нагреваться до 135℃ в течение 15 минут. Чтобы определить выживаемость спор после экструзии, пластик растворяли диметилформамидом. Выживало всего 20% спор дикого типа и 96–100% спор, устойчивых к тепловому шоку. Рентгеновская микроскопия также показала, что споры дикого типа разрушились в ходе производства пластика из-за высоких температур и механического стресса, в то время как устойчивые споры сохраняли морфологию.

Бактериальные споры улучшили все механические параметры термопластичного полиуретана, включая прочность, относительное удлинение при разрыве, предел прочности при растяжении и модуль продольной упругости Юнга. Хотя и споры дикого типа, и устойчивые к тепловому шоку споры положительно сказывались на механических свойствах пластика, последние оказывали наибольшее влияние. Исследователи связали это с тем, что они сохранили свою естественную структуру, из-за чего увеличилась площадь взаимодействия спор с пластиком.

Чтобы оценить биоразлагаемость полиуретана, образцы помещали в активный и проавтоклавированный компост при температуре 37℃ и влажности 45–55%. Через пять месяцев разложилось 92,7% полиуретана со спорами, устойчивыми к тепловому шоку; в обычном полиуретане и пластике со спорами дикого типа потеря массы составила 43,9% и 63,6%, соответственно. Что важно, высокая биоразлагаемость достигалась и в стерильном, и в нестерильном компосте. При этом секвенирование 16S рРНК бактериальных сообществ компоста подтвердило, что после помещения полиуретана в компост в нем значительно повысилось содержание бактерий рода Bacillus. Это свидетельствует о том, что споры успешно прорастали, давая начало бактериям.

Исследователи также продемонстрировали, что в пластик можно помещать споры генетически модифицированных бактерий. Они трансформировали бактерий плазмидой, несущей ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), а затем поместили ее споры в пластик. Флуоресценция детектировалась в спорах, содержащихся в полиуретане. Таким образом, можно «программировать» бактерий для выработки вспомогательных полезных веществ, что может быть использовано биоинженерами в дальнейшей разработке биокомпозитов с необычными свойствами.

Арктические микроорганизмы разлагают пластик при низких температурах