В гене транспортного белка SLC13A5 выявлены новые варианты, ассоциированные с эпилептической энцефалопатией

Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса) — ключевой процесс клеточного метаболизма, в ходе которого органические вещества превращаются в энергию. Основной метаболит цикла Кребса — цитрат, анион лимонной кислоты, который регулирует равновесие между реакциями гликолиза и синтеза жирных кислот. Известно, что цитрат-ион является нейромодулятором и в высоких концентрациях содержится в спинномозговой жидкости. Он транспортируется в клетки с помощью мембранного переносчика — белка SLC13A5. Мутации в гене SLC13A5 связаны с высоким уровнем внеклеточного цитрата и даже в рецессивном состоянии приводят к тяжелой форме эпилепсии, связанной с нарушением развития мозга (эпилептической энцефалопатии развития), сопровождаемой судорогами, уменьшением числа или недоразвитием зубов, когнитивными и двигательными нарушениями. Однако до сих пор лишь про небольшую часть однонуклеотидных вариантов (SNV) гена SLC13A5 было известно, вовлечены ли они в развитие заболевания и в какой степени они патогенны.

Ученые из Центра молекулярной медицины в Австрии изучили влияние 9707 из теоретически возможных 10 773 замен отдельных аминокислот в SLC13A5 на активность транспорта цитрата. Они также отобрали 38 вариантов для проверки в экспериментальных условиях, чтобы исследовать молекулярные механизмы патогенности. Результаты исследования опубликованы в Science Advances.

Исследователи создали библиотеку мутагенеза SLC13A5, покрывавшую 89,1% всех возможных одиночных миссенс-мутаций. Функциональную эффективность каждого из вариантов изучали на линии клеток эмбриональной почки человека HEK 293, поскольку SLC13A5 эти клетки в норме не экспрессируют. Согласно более ранним исследованиям, высокий уровень внеклеточного цитрата приводит к митохондриальной индукции апоптоза клеток. Авторы использовали это наблюдение для непрямого измерения SLC13A5-опосредованного транспорта цитрат-ионов: если эффективность транспорта была снижена мутацией в гене SLC13A5, это уменьшало чувствительность клеток к цитрату. Сравнив токсичность цитрата для клеток HEK 293, не экспрессирующих SLC13A5, экспрессирующих дикий тип белка или белок с известными ассоциированными с болезнью заменами аминокислот, исследователи определили оптимальное окно концентраций цитрата в среде для сканирования библиотеки мутагенеза.

Функциональную значимость мутаций ученые определяли с помощью статистического анализа в программном обеспечении Enrich2. Было классифицировано 90,2% (9719 из 10 773) всех возможных вариантов, приводящих к аминокислотным заменам: 5952 (55%) отнесены к нейтральным и 3767 (35%) — к вредным. Последние чаще встречались в сайтах, ответственных за связывание субстрата, координацию иона натрия и взаимодействие мембранных сегментов белка. Вредные мутации могут приводить к нарушению фолдинга белка, нарушать посттрансляционную модификацию или прямо разрушать функциональные участки.

Для более подробной функциональной оценки авторы выбрали 38 вариантов. Среди них были варианты, который встречались у пациентов, но относились к вариантам неопределенной значимости, не были ранее категоризированы или имели противоречивые клинические интерпретации. Также авторы включили в исследование три варианта с крайними значениями функциональной оценки (три «полезных» и три «вредных») а в качестве контроля взяли три известных патогенных или вероятно патогенных варианта.

Экспрессия и локализация SLC13A5 на плазматической мембране — обязательное условие для функционирования транспортного белка. Авторы применили метод иммунофлуоресценции, чтобы определить местоположение каждого из 38 вариантов SLC13A5 в клетках HEK 293. Двенадцать из них оказались сконцентрированными в эндоплазматическом ретикулуме и, очевидно, были неспособны транспортировать цитрат в клетку, то есть должны быть высоковредными. Интересно, что девять из этих 12 мутаций были обнаружены у пациентов, страдающих эпилептической энцефалопатией. Анализ in silico показал, что многие из них должны дестабилизировать структуру белка. Кроме того, авторы выявили 10 вариантов, при наличии которых белок, хотя и локализовался в плазматической мембране, не мог транспортировать цитрат в клетку. Оставшиеся 16 вариантов, по-видимому, не препятствовали транспорту цитрата.

Среди исследованных вариантов 201 присутствовал у участников UK Biobank, поэтому для них удалось сопоставить геномные и фенотипические данные. Авторы предположили, что более вредные, согласно их анализу, варианты в гене транспортера цитрата должны ассоциироваться с более высокими концентрациями цитрата в плазме крови, и такая корреляция действительно была обнаружена. Более того, у носителей многих вариантов, неспособных импортировать цитрат в клетку in vitro, уровень цитрата превышал 0,2 мМ.

«Наша работа подчеркивает важность систематического изучения влияния генетических вариантов. В особенности при таких редких заболеваниях, как дефицит цитратного транспортера SLC13A5 – специфической форме эпилепсии — этот подход помогает нам раскрыть молекулярные механизмы заболевания», — говорит руководитель работы Джулио Суперти-Фурга. Авторы надеются, что полученные данные позволят составить более полную картину генетического разнообразия популяции и оценить его влияние на здоровье человека.

Российские ученые исследовали влияние вариантов гена SCN1A, ассоциированного с эпилепсиями, на сплайсинг