Производное непопулярного анальгетика сделало голову мыши прозрачной

Рассеяние света в биологических тканях сильно затрудняет прижизненную глубокую визуализацию. В прошлом году ученые из Стэнфордского университета предложили способ обратимо сделать ткани прозрачными — они обработали кожу мышей раствором тартразина, чтобы наблюдать моторику внутренних органов in vivo (подробнее — в обзоре на  PCR.NEWS). Теперь коллектив под руководством тех же ученых разработал метод неинвазивной визуализации головного мозга живой мыши — и, в отличие от обработки тартразином, он совместим с анализом экспрессии флуоресцентных меток.

В основе метода лежит тот же принцип, что и в опытах с тартразином — оптическая прозрачность живых тканей достигается за счет обработки молекулой с сильным поглощением. Ученые предположили, что идеальная молекула для таких целей должна поглощать преимущественно в ультрафиолетовом (УФ) спектре, не препятствуя прохождению видимого света. Исходя из того, как распределение электронных плотностей в молекуле влияет на спектр ее поглощения, они выбрали для этой работы ампирон — производное обезболивающего препарата аминофеназона.

У ампирона широкий пик поглощения — его основная часть приходится на 220–320 нм, а довольно протяженное плечо достигает 400 нм и довольно резко обрывается. Иными словами, молекула интенсивно поглощает УФ, а поглощение в видимой области незначительно — это позволяет сильно менять показатель преломления в водных растворах. Кроме того, у ампирона небольшая молекулярная масса (203 г/моль), он растворим в воде и эффективно диффундирует в тканях, а также обладает низкой токсичностью (в отличие от самого аминофеназона).

Сначала применимость ампирона для повышения прозрачности тканей проверяли на рассеивающих гидрогелях, изготовленных из 1%-ной агарозы с микрочастицами кремнезема. Эти гидрогели размещали на светодиодной панели и оценивали, как меняется пропускание света в зависимости от количества ампирона. В его отсутствие линии сетки на панели были полностью скрыты гидрогелем, а по мере увеличения концентрации ампирона они становились все более заметными. Максимальная видимость наблюдалась при концентрации 38%.

Прозрачность гидрогелей при разных концентрациях ампирона.
Credit:
bioRxiv (2025). DOI: 10.1101/2025.02.20.639185 | CC BY-NC-ND

Далее ученые оценили способность ампирона повышать оптическую проницаемость биологических тканей ex vivo. Кожу живота мышей инкубировали в растворах ампирона различной концентрации. Как и в случае с гидрогелями, 38%-ная концентрация ампирона обеспечивала почти полную прозрачность, а более высокие концентрации ее снижали. Обработка ампироном обеспечивала прозрачность и in vivo — поверхностное нанесение 38%-ного раствора на кожу живота живых мышей позволяло детально визуализировать органы брюшной полости.

Повышение оптической проницаемости живых тканей обратимо — соединение можно вымыть физраствором. После вымывания ампирона состояние кожи мышей не отличалось от исходного (до начала эксперимента) или от контрольных животных, которых обрабатывали только физраствором, — как внешне, так и по данным гистологического анализа. Отклонений не наблюдалось и в последующие 14 дней, а шерсть, которую сбрили с живота мыши перед опытом, нормально отросла за это время.

Прозрачность кожи на животе мыши до и после обработки ампироном.
Credit:
bioRxiv (2025). DOI: 10.1101/2025.02.20.639185 | CC BY-NC-ND

Наконец, ученые показали, что ампирон позволяет неинвазивно проводить двухфотонную микроскопию через кожу головы у живых мышей. В коре головного мозга мышей экспрессировали желтый флуоресцентный белок (YFP). Его неинвазивная детекция была несовместима с предыдущим подходом — спектр поглощения тартразина мешал визуализировать флуоресценцию YFP. Каждое животное подвергали микроскопии до и после обработки кожи головы ампироном, проводя съемку флуоресценции на глубине 300 и 400 мкм. Если до обработки почти никакие сигналы не детектировались через кожу, то после нее стало возможно различить четкие структуры нейронов, экспрессирующих флуоресцентную метку.

Трехмерная реконструкция флуоресценции YFP в нейронах мыши до и после обработки ампироном.
Credit:
The Hong Lab | пресс-релиз

Метод подходит и для функционального кальциевого имаджинга с помощью GCaMP. Ученые вводили новорожденным мышам аденоассоциированный вирусный вектор, чтобы экспрессировать GCaMP в нейронах коры правого полушария. Визуализацию проводили через 21 день на бодрствующих мышах, отслеживая реакцию нейронов на сенсорные стимулы (импульсные потоки воздуха, направленные на усы или мордочку). Три из шести выбранных нейронов активно отвечали на стимуляцию выбросами кальция, еще у трех ответ был минимальный. Разрешение визуализации через прозрачную кожу головы было сопоставимо с тем, которое достигалось классическим способом — микроскопией после удаления участка кожи.

Авторы дополнительно подтвердили безопасность метода, проведя протеомный анализ образцов кожи. Они не выявили значимого повышения уровня маркеров апоптоза после воздействия ампирона.

Таким образом, ученые продемонстрировали, что оптическую прозрачность тканей in vivo, которая ранее ограничивалась проницаемостью красного света, можно расширить на весь видимый спектр. Благодаря этому новый метод позволяет неинвазивно проводить съемку флуоресценции YFP или кальциевого сенсора GCaMP (он излучает в том же спектре, что и GFP) в мозге живой мыши без удаления кожи головы или черепа.