Птичьи ретротранспозоны повышают безопасность вставки трансгенов

CRISPR-Cas-системы часто используют для исправления точечных мутаций или «выключения» генов, однако их применение для вставки полноразмерных трансгенов ограничено. Это связано с риском нецелевой (off-target) вставки, которая может нарушить работу других генов. Американские ученые предложили новую систему на основе ретротранспозона R2, которая решает эту проблему.

R2 встречается у разных организмов и кодирует одноименный белок, который совмещает в себе функции никазы и обратной транскриптазы. Он делает ник — одноцепочечный разрыв — в сайте вставки в ДНК, после чего проводит обратную транскрипцию с РНК-матрицы, таким образом вставляя свою копию в геном. У млекопитающих R2 отсутствует, но сохранился сайт вставки, что говорит о том, что в процессе эволюции этот ретротранспозон был утерян. Сайт вставки у R2 находится в локусе генов, кодирующих рРНК. В геноме человека такие гены представлены в количестве 400 копий, и нарушение функций нескольких из них никак не сказывается на жизнедеятельности клетки. Именно поэтому ученые рассматривали R2 как инструмент для вставки трансгенов.

Новая система называется PRINT — точная вставка трансгенов посредством РНК (precise RNA-mediated insertion of transgenes). Для ее применения в клетку доставляется две РНК: мРНК белка R2 и РНК трансгена, который необходимо вставить. В экспериментах лучше всего себя показали R2 птиц — зебровой амадины и белогорлого воробья.

Ученые проверили работу системы PRINT, трансфицировав РНК зеленого флуоресцентного белка (GFP) в клетки пигментного эпителия сетчатки человека. Экспрессию флуоресцентного белка проверяли проточной цитофлуориметрией, а правильность вставки — ПЦР. Экспрессия белка наблюдалась более чем в 10% трансфицированных клеток, и эта доля повышалась при увеличении концентрации доставляемой РНК. В 50% случаев ученые добились вставки полноразмерного трансгена (две килобазы). Аналогично они доставили в клетки матрицу общей длиной в 4,5 килобазы, содержащую промотор CMV, РНК теломеразной обратной транскриптазы (TERT), а также сигнал полиаденилирования. С помощью ПЦР и теста на теломеразную активность авторы подтвердили, что такая вставка тоже прошла успешно.

Далее исследователи оценили стабильность экспрессии трансгенов. Для этого они доставляли в клетки мРНК R2 и матрицу с РНК GFP и красного флуоресцентного белка mCherry, который служил репортером трансфекции. Через четыре часа после трансфекции более чем в трети клеток детектировался сигнал mCherry, а через шесть часов обнаруживался и сигнал GFP. При этом ученые не зарегистрировали признаков повреждения ДНК, и трансфицированные клетки не уходили в апоптоз или некроз. Однако они заметили, что после нескольких пассажей трансфицированных клеток доля GFP+ клеток снижалась, то есть делились преимущественно те клетки, которые не несли трансген. В качестве решения ученые модифицировали R2 таким образом, чтобы снизить его эндонуклеазную активность. При использовании такого R2 доля GFP+ клеток, детектированных через день после трансфекции, снизилась с 45% до 6%, но при этом трансген экспрессировался стабильно при пассажах клеток. Дальнейший анализ с помощью цифровой ПЦР в каплях (ddPCR) показал, что модификация R2 снизила количество вставок трансгена практически в 40 раз, с 10 вставок на клетку до 0,2–0,3. При этом в обоих случаях полноразмерный трансген получали в 50% клеток. Однако именно при малом количестве вставок трансген никак не мешал делению клеток и стабильно передавался следующим клонам.

Специфичность вставок ученые дополнительно подтверждали, проводя полногеномное секвенирование GFP+ клеток. Вставка проходила практически бесшовно, точно по указанному сайту. При этом нецелевые вставки встречались всего в 0,1-1% случаев. С помощью нанопорового секвенирования исследователи подтвердили, что сами вставки действительно являются полноразмерными. Они также выявили, что частота ошибок в гене очень низкая — 1 ошибка на 10 000 нуклеотидов, что согласуется с точностью синтеза кДНК с матрицы РНК.

Таким образом, ученые представили новый инструмент для редактирования генома, который позволяет вставлять в него полноразмерные трансгены с минимальным риском нарушения работы других генов. Исследователи считают, что в будущем PRINT не заменит CRISPR, но дополнит его. Одно из преимуществ метода — использование в качестве матрицы для вставки РНК, а не ДНК, что потенциально сможет снизить иммунный ответ при попадании чужеродной ДНК в клетки. При этом по сравнению с другими методами, в которых используется РНК, такими как праймированное редактирование и технологии на основе ретронов, PRINT может доставлять вставки бóльших размеров и имеет меньшие риски нецеловых вставок.

В PRINT трансгены доставляются в локус генов, кодирующих рРНК. Помимо того, что нарушение работы нескольких копий таких генов, скорее всего, никак не повлияет на жизнедеятельность клетки, у такого подхода есть еще одно преимущество. Локусы рРНК на акроцентрических хромосомах располагаются в ядрышке, где репарация ДНК регулируется особенно сильно. Так, если обычно разрывы в ДНК восстанавливаются за счет менее точного негомологичного соединения концов (NHEJ), в ядрышке преимущественно встречается именно гомологичная рекомбинация. Благодаря этой особенности любые повреждения ДНК при вставке трансгена будут быстро устранены.

У птиц обнаружили дозовую компенсацию Z-хромосомы