ПЦР-тесты могут давать ложноотрицательный результат при однонуклеотидных заменах в SARS-CoV-2

Ученые обнаружили, что точечная мутация в гене E коронавируса ассоциирована с ложноотрицательным результатом коммерческого ПЦР-теста. Проверка влияния однонуклеотидных замен в генах-мишенях с чувствительностью тестов осложнена недостатком информации о последовательностях праймеров.

Credit:
Iliescu Catalin | 123rf.com

На данный момент золотым стандартом диагностики COVID-19 считается количественная ОТ-ПЦР в реальном времени. Однако на чувствительность метода могут влиять точечные мутации в геноме вируса. В новом обзоре, опубликованном на портале Genomeweb, авторы описали влияние однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) на чувствительность ПЦР-тестов.

Залог успеха тестирования с помощью ОТ-ПЦР РВ заключается в комплементарности праймеров характерным участкам генома вируса. Поскольку праймеры — это достаточно короткие фрагменты нуклеиновой кислоты, одна замена нуклеотида в таргетном локусе может привести к провалу всего теста.

Ген Е нового коронавируса используется в качестве мишени в 25 коммерческих ПЦР-тестах. Однако согласно новой статье, опубликованой в Journal of Clinical Microbiology, замена цитозина на урацил в позиции 26 340 генома SARS-CoV-2 может привести к ложноотрицательному результату ПЦР, нацеленной на регистрацию данного локуса.

Ученые проводили рутинное тестирование пациентов на SARS-CoV-2 с помощью коммерческого теста на платформе cobas 6800 (Roche). Данная система проверяет наличие в пробе двух генов коронавируса: Е и ORF1ab. В восьми случаях тест на ген Е оказался отрицательным, в то время как тест на ORF1ab говорил о наличии вируса в пробе (образцы были классифицированы как патоген-положительные). Полногеномное секвенирование этих образцов выявило замену C на U в позиции 26 340, которая попадает в ген Е коронавируса.

Ученые предположили, что этот SNP послужил причиной двойственных результатов, однако производитель тестов отказался предоставлять точные последовательности праймеров, и авторы не смогли подтвердить свою гипотезу экспериментально. Кроме того, нельзя утверждать, что остальные коммерческие тест-системы также не смогли бы детектировать ген Е в этих образцах: результат теста зависит от последовательностей используемых праймеров. При повторном тестировании четырех из восьми пациентов с помощью некоммерческого ПЦР-набора ген Е детектировался нормально.

В отличие от ORF1ab, ген Е встречается не только у SARS-CoV-2, но и у других коронавирусов. Анализ геномов нового коронавируса из базы GISAID показал, что замена на урацил в соответствующем локусе не очень распространена (встречается с частотой 0,09%), однако она возникала независимо по крайней мере четыре раза. Кроме того, эта мутация также встречается и в родственных коронавирусах.

ПЦР-тесты, использующие в качестве мишени несколько генов вируса, устойчивы к полиморфизмам вирусной РНК. Если ПЦР не регистрирует один характерный ген, ее может «подстраховать» реакция, нацеленная на другой участок генома.

В тест-системах используются праймеры не только к гену E, но и к другим участкам генома SARS-CoV-2: нуклеокапсидному гену N, гену РНК-зависимой РНК-полимеразы RdRp, а также гену S-белка. На конец июля 2020 года FDA одобрило для экстренного использования 118 ПЦР-тестов на SARS-CoV-2. 18 из них нацелены на детекцию трех различных локусов, 39 — двух и 61 — только одного.

Так как ген Е не уникален для SARS-CoV-2, он никогда не используется в качестве единственной мишени. Однако однонуклеотидные полиморфизмы могут возникать и в других локусах. Таким образом, более половины тестов теоретически могут давать ошибки, связанные с SNP в соответствующих генах. Ситуация осложняется тем, что компании часто не предоставляют информацию об используемых праймерах.

Компания Сepheid уже заявила о том, что на чувствительность их теста не влияют SNP в гене E коронавируса. Однако авторы статьи в JSM настаивают, что данные об используемых реагентах должны быть доступны для отслеживания потенциально проблемных мутаций патогена.

«Эта работа показывает, насколько опасно полагаться всего лишь на один характерный фрагмент генома. Она также подчеркивает пользу дополнительного секвенирования положительных образцов, особенно в тех случаях, когда одна из тестовых реакций дает сбой», — заключают авторы.

Источники

SARS-CoV-2 E Gene SNP Raises Concerns About Test Accuracy, Transparency

Maria Artesi, et al. // A recurrent mutation at position 26,340 of SARS-CoV-2 is associated with failure of the E-gene qRT-PCR utilized in a commercial dual-target diagnostic assay. // Journal of Clinical Microbiology, Jul 2020; DOI: 10.1128/JCM.01598-20

Добавить в избранное

Вам будет интересно