Редактор оснований улучшает CRISPR-скрининг функций генов

Новый метод полногеномного скрининга, использующий редактор цитозина для выключения генов, лишен некоторых недостатков скрининга c использованием CRISPR-Cas9. Например, он не требует внесения двухцепочечных разрывов в ДНК, клеточный ответ на которые приводит к ошибкам в интерпретации результатов.

Credit:
molekuul | 123rf.com

Китайские ученые разработали метод полногеномного CRISPR-скрининга на основе редактора цитозина (CBE) — цитидин-дезаминазы, сшитой с никазой nCas9. Метод получил название BARBEKO (iBARed cytosine base editing-mediated gene KO).

При классическом CRISPR-скрининге с ипользованием нуклеазы Cas9 нокаут генов достигается за счет двухцепочечных разрывов. Ответ клетки на разрывы может быть ошибочно принят за последствия нокаута. BARBEKO позволяет избегать двухцепочечных разрывов: редактирование происходит таким образом, чтобы из-за замены цитозина в последовательности гена нарушался старт-кодон, сайт сплайсинга либо возникал преждевременный стоп-кодон.

Ученые применили BARBEKO для нокаутирования 17 501 человеческих генов в культурах клеток. К каждому гену они подобрали по три гидовых РНК, чтобы исключить ошибку из-за нецелевого редактирования или неэффективного нокаута. Каждая гидовая РНК была снабжена внутренним баркодом для последующего секвенирования (iBAR; технологию внутренних баркодов эта же команда представила ранее).

Скрининг производили следующим образом: культуру клеток, экспрессирующих редактор цитозина, заражали библиотекой лентивирусов, несущих последовательности гидовых РНК. Клетки пересевали несколько раз, собирали на 15–21 день и с помощью NGS определяли, последовательностями каких гидовых РНК библиотека обогатилась, а каких стало существенно меньше. Клеток с нокаутом жизненно важных генов в результате будет мало в культуре.

Эксперимент проводился на культуре клеток HeLa и линии K562 с разными концентрациями лентивирусных частиц (три и десять на клетку соответственно). Было показано, что увеличенная доза вируса дает возможность проводить скрининг на меньшем количестве клеток, что может быть полезно при анализе клинических образцов.

BARBEKO также успешно применили к линии иммортализованных клеток RPE1. Скрининг с использованием CRISPR-Cas9 для таких клеток был осложнен, так как вызывал p53-зависимый ответ и арест клеточного цикла.

Сравнивая гидовые РНК, направленные на разные участки, авторы отмечают, что редактирование старт-кодонов менее эффективно для нокаута генов, чем редактирование сайтов сплайсинга или введение стоп-кодонов. Причиной этому могут быть альтернативные старты трансляции.

Помимо исключения нецелевых эффектов, вызванных внесением двухцепочечных разрывов, авторы отмечают лучшую воспроизводимость системы BARBEKO по сравнению со скринингом с использованием CRISPR-Cas9. Это может быть связано с тем, что при восстановлении двухцепочечных разрывов возникает вариативность, например, различные делеции.

Таким образом, скрининг без внесения двухцепочечных разрывов менее отягощен побочными эффектами, может проводиться на меньшем числе клеток и более воспроизводим, чем скрининг с использованием CRISPR-Cas9. Авторы считают, что BARBEKO дополнит существующие методы.

Источник

Xu, P., et al. // Genome-wide interrogation of gene functions through base editor screens empowered by barcoded sgRNAs. // Nature Biotechnology, 2021; DOI: 10.1038/s41587-021-00944-1

Добавить в избранное

Вам будет интересно