Шаперон GRP78 перемещается в ядро и мешает регуляторному белку ингибировать онкогены

Белок GRP78 — основной шаперон эндоплазматического ретикулума (ЭПР), который также выполняет регуляторные функции в других компартментах клетки. Он индуцируется при разных видах рака и считается антиапоптотическим белком, то есть препятствует гибели раковых клеток. Ранее было обнаружено, что нокдаун GRP78 в клетках рака поджелудочной железы мыши приводит к снижению экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), играющего фундаментальную роль в клеточной пролиферации, дифференцироке и подвижности. Оверэкспрессия EGFR тесно связана с плохим прогнозом при широком спектре онкологических заболеваний. В новой работе ученые охарактеризовали механизмы транслокации белка GRP78 из ЭПР в ядро и его влияние на транскрипцию генов, кодирующих EGFR и ID-2 (ингибитор ДНК-связывающего белка 2, проявляющий противоопухолевую активность при раке легких).

Шапероны — это белки, участвующие в фолдинге и процессинге других белковых молекул. В последнее время стало известно, что они также регулируют клеточный гомеостаз — как в норме, так и при различных заболеваниях. Один из таких шаперонов — GRP78 (также известный как BiP) — кодируется геном HSPA5 и относится к семейству белков теплового шока HSP70. Помимо своих основных функций, GRP78 играет роль ключевого регулятора ответа на неправильно свернутый белок (UPR), который сопровождает многие онкологические, метаболические и неврологические заболевания. Накопление в ЭПР несвернутых или неправильно сложенных белков индуцирует стресс ЭПР, и повышается экспрессия шаперонов, отвечающих за нормализацию синтеза белка. Недавно было обнаружено, что при стрессе ЭПР шапероны перемещаются из ЭПР в другие компартменты и начинают выполнять регуляторные функции. Например, GRP78 может перемещаться в митохондрии и ядро, однако механизм такой транслокации и олль GRP78 в ядре пока были изучены слабо.

Ученые проанализировали Атлас ракового генома (TCGA) и выяснили, что экспрессия мРНК GRP78 в аденокарциноме легкого человека выше, чем в нормальных тканях легкого, и является плохим прогностическим маркером выживаемости пациентов. Поскольку белок EGFR — важная терапевтическая мишень при раке легких, авторы работы попытались найти связи между ним и GRP78. Они проводили нокдаун GRP78 на семи линиях немелкоклеточной карциномы легкого человека, несущих различные генотипы EGFR (включая мутантные и амплифицированные аллели). Результаты вестерн-блоттинга показали, что снижение GRP78 приводило к значительному сокращению уровня белка EGFR во всех семи клеточных линиях.

Для того чтобы определить, на каком уровне подавляется EGFR в результате нокдауна GRP78 — на транскрипционном или трансляционном, — исследователи проанализировали экспрессию генов с применением обозревателя данных DepMap. Выяснилось, что GRP78 регулирует экспрессию EGFR на уровне транскрипции. Для экспериментального подтверждения этих результатов авторы измерили уровни мРНК в клетках. При нокдауне GRP78 уровень мРНК EGFR снижался на 50% по сравнению с контролем.

С помощью репортерной люциферазы под промотором EGFR человека ученые проверили, связано ли подавление белка EGFR с воздействием на промотор гена. Репортерная конструкция была устроена таким образом, что люцифераза активировалась при взаимодействии с промотором гена EGFR. Высокая люциферазная активность наблюдалась в клетках с функционирующим GRP78, а в клетках с нокдауном GRP78 она подавлялась. В клетках с нокдауном GRP78 свечение отсутствовало, из чего можно сделать вывод, что белок GRP78 регулирует активность промотора EGFR.

Авторы также изучили клетки рака легкого при помощи конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Они обнаружили, что белок GRP78 присутствует как в ЭПР, так и в ядре. При этом GRP78 не обнаруживался в ядре клеток эпителия бронхов легкого в нормальных условиях культивирования, однако появлялся в ядре после обработки тапсигаргином — индуктором стресса ЭПР. Таким образом, было показано, что белок GRP78 рекрутируется в ядро клеток при раке или при стрессе ЭПР.

Кроме того, ученые обнаружили в белке GRP78 сигнал ядерной локализации (NLS) —сигнальную последовательность из 16 аминокислот между 275 и 290 аминокислотными остатками, богатую лизином. Три остатка лизина (K276, K280, K287) в последовательности NLS экспонированы на поверхности белка. Исследователи установили, что именно эта последовательность отвечает за импорт GRP78 в ядро.

С помощью базы данных картирования интерактомов эталонных белков человека авторы выяснили, что GRP78 взаимодействует с ядерным белком ID2. Этот белок подавляет некоторые гены и служит негативным прогностическим маркером выживаемости среди пациентов с аденокарциномой легких. Дальнейшие эксперименты показали, что GRP78 сближается с ID2 в ядре. Белок ID2 подавляет экспрессию EGFR в раковых клетках, причем на уровне как транскрипции, так и трансляции, а GRP78, в свою очередь, связывает ID2, снижая его супрессорную активность, и восстанавливает экспрессию EGFR. Таким образом, GRP78 регулирует транскрипцию EGFR посредством блокирования супрессивной активности ID2.

Исследователи также обнаружили, что белок ID2, известный своим супрессивным влиянием на опухоли, подавляет гены, отвечающие за миграцию и инвазию раковых клеток, а белок GRP78, попадая в ядро клетки и связываясь с ID2, способствует повышению экспрессии этих генов.

Таким образом, авторы работы обнаружили молекулярные взаимодействия белка GRP78 с ID2, которые демонстрируют его роль в регуляции экспрессии генов, связанных с миграцией и инвазией раковых клеток. Эти сведения позволят лучше понять механизмы образования метастазов, а впоследствии помогут разработать способы предотвращать метастазирование.

Шапероны на страже синуклеина