Тиоэфир в оболочке выдает туберкулезную микобактерию внутри макрофагов

Туберкулез ежегодно уносит более миллиона человеческих жизней, оставаясь одной из ведущих причин смерти от инфекционных заболеваний. Важным фактором патогенности для туберкулезной микобактерии (Mycobacterium tuberculosis) служат гликаны, входящие в состав клеточной оболочки. Один из них — липоарабиноманнан (LAM), который у туберкулезной микобактерии кэпирован остатками маннозы, — участвует в проникновении в клетку хозяина, препятствует созреванию фаголизосомы и модулирует иммунные сигналы. Авторы статьи в PNAS воспользовались редким моносахаридом в его составе — метилтиоксилофуранозой (MTX) — в качестве мишени, чтобы избирательно пометить клетки возбудителя туберкулеза и синтезируемые в них гликаны. Это позволило отличить туберкулезную микобактерию от непатогенных родственных видов и создать систему для детекции патогена в организме.

MTX — уникальный остаток сахара, содержащий тиоэфирную группу. Он встречается только у туберкулезной микобактерии и двух родственных ей патогенов. Для мечения исследователи нацелились именно на тиоэфирную группу и применили биоконъюгацию с оксазиридинами — эти соединения способны активно реагировать с тиоэфирами. Ученые использовали азидопропилоксазиридин (AzOx) — его оксазиридиновый фрагмент взаимодействует с тиоэфирной группой, а азидная группа служит для последующего мечения мишени биотином по механизму азид-алкинового циклоприсоединения. Встроившийся в молекулу биотин затем легко обнаружить меченным стрептавидином.

Применимость подхода для селективного мечения MTX проверили на очищенных гликанах и подтвердили на клетках туберкулезной микобактерии (контролем служил другой представитель рода Mycobacterium, не имеющий MTX в клеточной оболочке). Отдельно авторы убедились, что тиоэфирная стратегия мечения позволяет отличить MTX-содержащие липоарабиноманнаны от других гликанов.

Поскольку мечение с помощью оксазиридинов не требует фиксации клеток и окрашивания антителами, оно дает возможность отслеживать MTX в инфицированных клетках хозяина. Авторы работы наблюдали за локализацией MTX-содержащих LAM в человеческих макрофагах — основной физиологической нише для инфекции туберкулезной микобактерией.

Для этого эксперимента ученые выделили моноциты из периферической крови здоровых доноров и дифференцировали их в макрофаги. Затем их культивировали в присутствии M. tuberculosis. Окрашивание AzOx выявило бактериальные септы внутри макрофагов, которые не окрашивались другими методами. Иными словами, предложенный метод позволял обнаружить деление микобактерий в макрофагах. Кроме того, он подтвердил, что оболочка бактериальной клетки сохраняет структурную целостность даже в фагосоме хозяина, в том числе при дополнительной стимуляции макрофагов интерфероном γ и липополисахаридом.

Важно, что стабильности метки хватало для длительных наблюдений — сигнал сохранялся в течение 24 ч часов при pH 5,2 (такие условия характерны для фагосомы макрофагов). К 72 часам он незначительно ослабевал, но все еще надежно детектировался.

Таким образом, оксазиридиновые соединения перспективны для селективного мечения гликана в составе клеточной стенки M. tuberculosis — как в самих бактериях, так и в контексте инфекции хозяина. Авторы рассчитывают, что созданный подход позволит детально проанализировать маршрут и динамику перемещения этого ключевого фактора патогенности в инфицированном организме, чтобы лучше понимать биологию туберкулезной палочки и создавать методы борьбы с ней.

Туберкулезная микобактерия с аварийным выключателем позволит изучать вакцины от туберкулеза на людях