Ученые приспособили РНК-секвенирование единичных клеток для небольших образцов

Новая система для подготовки к РНК-секвенированию единичных клеток делает возможным изучение небольших образцов, содержащих до 500 клеток. Возможности системы продемонстрировали на отдельных органоидах кишечника и кишечных криптах.

Микрофлюидная система DisCo.

Credit: Jörn Pezoldt (EPFL) | Пресс-релиз

Современные методы РНК-секвенирования практически не позволяют обрабатывать малые образцы (до 1000 клеток) по трем причинам. Во-первых, стоимость анализа не зависит от количества клеток, что делает секвенирование небольшого числа клеток невыгодным. Во-вторых, у многих систем сортировки есть требования по минимальному количеству клеток на входе (500–10 000 в зависимости от метода). Наконец, при обработке небольших, но гетерогенных образцов клетки слишком плохо захватываются, что приводит к низкой эффективности секвенирования. В результате возникают сложности при секвенирование единичных клеток для C. elegans, эмбрионов Danio rerio или небольших органоидов. Исследователям приходится объединять по несколько образцов вместе, что нежелательно, если образцы гетерогенны.

Ученые из Швейцарии, Бельгии и Германии разработали микрофлюидную систему, которая позволяет эффективно захватывать единичные клетки при работе с небольшими образцами и упаковывать их в капли с частицами, захватывающими РНК. Система получила название DisCo — deterministic, mRNA-capture bead and cell co-encapsulation dropleting system. DisCo использует машинное зрение, чтобы определять, где находятся клетки и РНК-захватывающие частицы, и управлять захватом клеток в капли. Поток жидкости контролируется с помощью микроклапанов. Манипуляции с микроклапанами позволяют собрать 95,9% частиц в определенной зоне системы, а также отрегулировать объем капли, в которую попадут клетка и частица. DisCo производит монодисперсные эмульсии с высокой эффективностью захвата объектов: 91,4% капель содержат и клетку, и РНК-захватывающую частицу.

Ученые испытали систему на отдельных органоидах кишечника и кишечных криптах мышей. С помощью DisCo они определили подтипы органоидов с необычным распределением типов клеток, которые не удавалось описать при помощи существующих подходов в РНК-секвенировании единичных клеток. Например, ученые выявили «гоблоиды» — кишечные органоиды, которые состояли в основном из взрослых бокаловидных (goblet) клеток, и обнаружили органоиды с большим количеством стволовых клеток. При этом все органоиды культивировались и дифференцировались в одинаковых условиях.

Анализ крипт также выявил гетерогенность их клеточного состава. При этом в криптах вместе с ожидаемыми типами клеток обнаружились кластеры стволовых клеток с регенеративным потенциалом.

Таким образом, система DisCo позволяет эффективно обрабатывать отдельные образцы, которые содержат всего несколько сотен клеток. Ученые надеются, что новый подход внесет свой вклад в изучение развития различных органоидов, а также поможет анализировать небольшие клинические образцы и исследовать связанную с патологическими состояниями клеточную гетерогенность.

Источник

Bues, J., et al. Deterministic scRNA-seq captures variation in intestinal crypt and organoid composition. // Nature Methods (2022), published 14 February 2022; DOI: 10.1038/s41592-021-01391-1

Добавить в избранное

Вам будет интересно