Установлена природа связи между углеводной цепочкой и нуклеозидом в гликоРНК

Малые некодирующие РНК в клетках млекопитающих иногда могут подвергаться гликозилированию, которое влияет на их функции и локализацию в клетке (например, они часто локализуются в мембране и служат лигандами для рецепторов). Гликозилированные РНК впервые были описаны в 2021 году. Руководила этой работой Каролин Бертоцци, получившая Нобелевскую премию 2022 года за биоортогональные клик-реакции, то есть реакции между компонентами, которые не встречаются в биосистемах. Биоортогональные реакции позволяют метить биомолекулы в живой клетке, в том числе углеводы, которые сложно визуализировать другими методами.

Бертоцци и соавторы использовали биоортогональные реакции для картирования гликанов на поверхности клеток. Такой подход они применили и для обнаружения гликоРНК (подробнее об этом открытии на PCR.NEWS). К культуре эукариотических клеток добавляли предшественник сиаловой кислоты с азидной группой — перацетилированный N-азидоацетилманнозамин (Ac₄ManNAz). Это вещество включалось в гликаны при их синтезе в клетке и активировало биортогональную реакцию с биотином, что и позволяло обнаружить меченые молекулы. Идея поиска гликоРНК принадлежала первому автору статьи Райану Флинну (в настоящее время сотрудник Гарвардского института стволовых клеток и Бостонской детской больницы), который нашел в литературе сведения о гликозилирующем ферменте, взаимодействующем с РНК. Райан Флинн — руководитель новой работы, результаты которой сейчас опубликованы в Cell, Каролин Бертоцци тоже входит в число ее соавторов.

До сих пор не было известно, как устроен «мостик» между сахаром и РНК с химической точки зрения. В этой работе исследователи показали, что N-гликаны присоединяются к РНК через модифицированный остаток урацила — 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин, или acp³U. Чтобы установить это, они разработали специальный метод. Проблема с Ac₄ManNAz состоит в том, что он неравномерно включается в гликановые цепи. Кроме того, химическая модификация углевода может исказить результат. Новый метод для мечения гликоРНК с сиаловой кислотой под названием rPAL (RNA-optimized periodate oxidation and aldehyde ligation) по чувствительности превосходит Ac₄ManNAz более чем в 25 раз. Мечеными оказываются нативные гликозилированные РНК, то есть синтезированные из природных компонентов.

В этом случае мечение проводили не в клетке, а в растворе очищенной РНК. Нативную сиалогликоРНК метили с помощью высокоспецифичных химических реакций (периодатное окисление диоловых групп сиаловой кислоты и последующее лигирование альдегидной группы с молекулой, содержащей аминогруппу). Таким путем к модифицированной молекуле сахара можно пришить, например, биотин, чтобы облегчить дальнейшую очистку. Этот метод объединили с мощным масс-спектрометрическим методом — SWATH-MS (sequential window acquisition of all theoretical mass spectra). Чтобы подтвердить эффективность и чувствительность метода, авторы выявили сиалогликоРНК в клетках периферической крови трех доноров, включая T- и B-клетки, моноциты и макрофагах, а также естественные киллеры и нейтрофилы.

После этого приступили к экспериментам по идентификации модифицированного нуклеотида, который служит линкером между РНК и гликановой цепочкой. РНК выделяли из эукариотических клеток (HEK293 и K562), метили содержащиеся в экстракте сиалогликоРНК методом rPAL, а затем очищали их с помощью нейтравидина. Потом РНК подвергали гидролизу, нуклеотид отделяли от гликана ферментом пептид:N-гликозидазой F (PNGaseF) и проводили SWATH-масс-спектрометрию. Сравнение полученных спектров с синтетическими стандартами показало, что N-гликаны присоединяются к РНК через модифицированный урацил — acp³U.

Известно, что acp³U в тРНК внедряют ферменты семейства DTWD. Авторы выполнили нокаут гена, кодирующего DTWD2, в клетках U2OS, и увидели, что этот нокаут снизил количество меток acp³U и acp³D (D – дигидроуридин) в составе РНК, причем на других метках это не отразилось. Следовательно, DTWD2 необходим для превращения остатков уридина в acp³U, а к ним, в свою очередь, присоединяются гликановые цепочки.

 Транспортные РНК (тРНК) синтезируются в ядре и модифицируются там или в цитозоле с помощью фермента DTWD2 по урацилу — возникает acp³U. Неизвестный фермент заменяет ОН-группу на вторую аминогруппу, после чего тРНК транспортируется в просвет эндоплазматического ретикулума. Там происходит N-гликозилирование по модифицированному урацилу; далее образуются зрелые сиалогликоРНК, которые экспонируются на поверхности клетки. Credit: Flynn Lab |  Пресс-релиз

Авторы работы отмечают, что acp³U встречается в РНК бактерий и других эукариот, помимо млекопитающих, однако его роль до сих пор была неясна. Идентификация природы химической связи между N-гликанами и тРНК — очередной шаг к пониманию биосинтеза и функций гликоРНК в клетке.

РНК вируса гепатита C кэпирована флавинадениндинуклеотидом