Вариант в гене PICALM повышает риск болезни Альцгеймера, «выключая» фагоцитоз в микроглии

Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее частая причина деменции. Уже обнаружено более 75 генетических локусов риска, однако конкретные функциональные варианты и клеточные механизмы для большинства из них неизвестны. Большая их часть расположена в некодирующих областях генома, что затрудняет интерпретацию. Хорошо изучен аллель APOE4, который считается основным генетическим фактором риска, но механизмы действия локуса PICALM (Phosphatidylinositol Binding Clathrin Assembly Protein) оставались невыясненными. Их проанализировали авторы статьи в Nature. Они обнаружили, что аллель, ассоциированный с повышенным риском БА, способствует аномальному накоплению липидных капель в микроглии.

Для поиска функциональных некодирующих вариантов авторы использовали транскриптомный и аллель-специфичный анализ открытого хроматина. Его проводили на клетках микроглии, астроцитах, а также глутаматергических, ГАМКергических и дофаминергических нейронах, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Биоинформатический анализ выявил от 202,019 до 267,119 областей открытого хроматина (open chromatin regions, OCR) в каждом типе клеток. Сильнее всего с генетическим риском БА с поздним началом были ассоциированы OCR микроглии. Вариант rs10792832 в локусе PICALM оказался главным функциональным кандидатом, влияя на его экспрессию через аллель-специфичное связывание транскрипционных факторов.

Для функциональной валидации варианта rs10792832 ученые получили изогенные пары iPSC линий двух здоровых доноров-носителей с помощью CRISPR-Cas9 редактирования. Генотип риска (G/G) в них заменили на «безопасный» (A/A). Отредактированные линии дифференцировали в индуцированные микроглиоподобные клетки (iMG). Экспрессию PICALM в них оценивали с помощью qPCR и Вестерн-блоттинга. Выяснилось, что аллель G приводил к 50% снижению экспрессии PICALM в клетках микроглии, чего не наблюдалось в астроцитах.

In silico анализ предсказал, что аллель G нарушает консенсусный мотив связывания транскрипционного фактора PU.1. Методом иммунопреципитации хроматина ученые подтвердили, что в гомозиготных линиях аллель G обеспечивал значительно меньшее связывание PU.1, а в гетерозиготных iMG аллель A связывался с PU.1 примерно в 2,5 раза эффективнее, чем аллель G. Таким образом, аллель rs10792832 специфично снижает экспрессию PICALM в микроглии, нарушая связывание фактора транскрипции PU.1. Функциональный анализ выявил, что у микроглии с аллелем риска на 40–50% снижалась способность поглощать β-амилоид и остатки разрушенных миелиновых оболочек. Оверэкспрессия PICALM полностью восстанавливала данную функцию, что подтвердило причинно-следственную связь.

Для изучения молекулярных механизмов такого нарушения ученые секвенировали РНК iMG. Анализ дифференциальной экспрессии генов в сочетании с генной онтологией выявил 501 такой ген. Из 20 наиболее существенно менявшихся более половины были вовлечены в метаболизм липидов и холестерина. Анализ обогащения путей выявил, что сильнее всего в клетках с аллелем риска активировались биосинтез холестерина и гены-регуляторы метаболизма липидов. Микроглия, транскриптом которой перестраивался таким образом из-за сниженной экспрессии PICALM, приобретала характерные для БА черты — при этой болезни клетки микроглии накапливают липидные капли.

Для визуализации липидных капель клетки окрашивали BODIPY и LipidTOX. Конфокальная микроскопия показала, что в них возрастали количество, размер и общей площади липидных капель. С помощью проточной цитометрии ученые также выявили увеличение доли клеток с высоким содержанием липидных капель. Для определения полного липидного профиля они провели липидомный анализ и обнаружили, что в микроглии с аллелем риска меняются уровни 55 липидов; из них 32 были триглицеридами.

Затем авторы проанализировали экспрессию генов, связанных с функцией лизосом. Они обнаружили, что 13 из 15 лизосомальных генов, подавленных в глии с APOE4, оказались подавлены и в iMG с аллелем риска PICALM. В этих клетках также снижалась экспрессия генов, подавляющих аккумуляцию липидных капель — SLC33A1, MCOLN1, GRN.

Для визуализации и количественной оценки лизосом их окрасили LysoTracker Red, а затем проанализировали колокализацию с липидными каплями. Общее количество лизосом оказалось повышено в 2,7–4,2 раза, а количество лизосом, колокализующихся с липидными каплями, — в 4,3–5,7 раза.

Результаты анализа обогащения также указали на окислительный стресс, который может вносить вклад в патогенез БА. Для проверки этого авторы окрасили клетки CellROX Deep Red — флуорогенным зондом на активные формы кислорода (АФК), и BODIPY-C11— сенсором перекисного окисления липидов. Уровень АФК в клетках с аллелем риска оказался повышен более чем вдвое, а окисление липидов в них протекало активнее. Ученые пришли к выводу, что дисфункция лизосом приводит к окислительному стрессу и перекисному окислению липидов, накопленных в каплях.

Связь между накоплением липидных капель и нарушением фагоцитоза, то есть дисфункцией лизосом, авторы доказали одновременным окрашиванием на фагоцитоз (его оценивали по накоплению флуоресцентно меченного β-амилоида) и липидные капли. Оказалось, что клетки с высоким содержанием липидных капель практически не фагоцитировали. Обработка триаксином C — ингибитором ацил-КоА-лигазы длинноцепочечных жирных кислот — уменьшала количество липидных капель в iMG с аллелем риска PICALM и восстанавливала фагоцитоз. Это свидетельствует о том, что нарушения фагоцитоза микроглии с данным аллелем вызваны накоплением липидных капель.

Авторы исследования охарактеризовали отдельный патологический процесс при БА — накопление липидных капель в микроглии — и выявили связь вариантов PICALM с дисфункцией микроглии. Это открывает стратегии терапии, направленные на липидный метаболизм микроглии.