Визуализация транскрипции в живых клетках

Группа ученых из Японии под руководством Хироши Кимуры из Токийского технологического института использовала флуоресцентный маркер активной РНК-полимеразы для обнаружения в клетке участков активно транскрибируемого хроматина. Транскрипция — один из центральных клеточных процессов, и новый метод позволяет непосредственно визуализировать ее в клетках.

РНК-полимераза II отвечает за транскрипцию большинства генов в эукариотической клетке. Ее С-концевой домен представляет собой «хвост», состоящий из 52 гептапептидных повторов, в положениях 2, 5 и 7 которых находятся остатки серина. Эти остатки серина могут быть фосфорилированы, причем различные паттерны их фосфорилирования соответствует разным состояниям РНК-полимеразы II. Например, фосфорилирование серина во втором положении (Ser2ph) происходит только при элонгации транскрипции, поэтому Ser2ph — маркер активной РНК-полимеразы II (за некоторыми исключениями: например, транскрипция генов малых ядерных РНК и гистонов происходит без фосфорилирования Ser2).

Ser2ph-связывающий флуоресцентный зонд представляет собой так называемое mint-антитело, или минтело (mintbody — modification-specific intracellular antibody внутриклеточное специфическое к модификации антитело). В клетку внедряется генетическая конструкция, кодирующая минтело. Оно включает по одному тяжелому и легкому вариабельному домену антитела, специфического к Ser2ph, а также флуоресцентный белок. Ранее технологию mint-антител авторы применяли для других целей, например, визуализации модификаций гистонов.

Полученный зонд после ряда аминокислотных модификаций приобрел устойчивость при экспрессии в клетках. Его способность связывать Ser2ph и не связывать Ser5ph и Ser7ph была показана in vitro. При экспрессии зонда в клетках HeLa формируются флуоресцентные области в ядре, число которых достигает 5000. Авторы соотносят эти точки с «транскрипционными фабриками», в каждой из которых одновременно активно множество РНК-полимераз. Удачной визуализации может способствовать большое число повторений Ser2ph в каждой молекуле РНК-полимеразы II. Время связывания зонда с модификацией очень мало, что свойственно mint-антителам.

Чтобы подтвердить специфичность связывания зонда с Ser2ph, клетки обрабатывали триптолидом, который вызывает деградацию РНК-полимеразы II, или флавопиридолом, который ингибирует киназу P-TEFb (она фосфорилирует Ser2). В обоих случаях флуоресценция уменьшилась, как и ожидалось. Зонд колокализовался с гистоном H2B, который соответствует деконденсированному хроматину, частично колокализовался с одной из субъединиц РНК-полимеразы II и не был колокализован с PCNA, который соответствует участкам с репликационной активностью. При митозе картина соответствовала представлениям о затухании транскрипционной активности в профазе с повторным появлением участков транскрипционной активности в G1 фазе.

Используя зонд, авторы выяснили, что подвижность точек, соответствующих транскрипционно активным участкам, выше, чем у реплицирующихся участков хроматина или участков, обогащенных фактором p300 (он ассоциирован с последовательностями энхансеров). Авторы говорят, что это свидетельствует о некоторой обособленности транскрибирующихся участков от остального хроматина.