Внутриклеточная киназа Src экспонируется на поверхности раковых клеток

Нацеливание на поверхностные маркеры раковых клеток, например, с помощью антител, — распространенный метод доставки лекарств в опухоль. При этом важно, чтобы мишень антител присутствовала на раковых, но не нормальных клетках. Авторы статьи в Science выявили белок, который может стать такой мишенью — это протоонкоген Src. Как оказалось, в раковых клетках он неканоническим образом экспонируется на поверхности и становится доступным для связывания антителами. 

Проанализировав протеом клеточной поверхности, ученые выявили 738 поверхностных белков, и из этого списка выделили 28 протеинкиназ. Среди них была ассоциированная с раком тирозинкиназа Src, которая оверэкспрессируется клетками многих видов рака. Прошлые исследования обнаруживали эту киназу в среде, где культивировали раковые клетки, однако секреторный механизм не был описан, а о наличии Src на поверхности клеток ранее не сообщалось.

С помощью проточной цитометрии исследователи подтвердили, что Srс присутствует на поверхности клеток гепатоцеллюлярной карциномы (HCC1569) и ряда других опухолевых линий. Поверхностная экспрессия сильно коррелировала с общим уровнем Src в иммортализованных и раковых клетках, а в нормальных клетках (например, эпителии мочевого пузыря) такого не наблюдалось.

В норме Src связан с внутренней стороной плазматической мембраны через N-концевой остаток миристоиловой кислоты. N-миристоилирование оказалось необходимо и для экспозиции на внешней мембране клетки. Авторы обрабатывали клетки HCC1569 нетоксичным ингибитором двух N-миристоилтрансфераз — IMP-1088. На общий уровень Src это не влияло, но существенно снижало его поверхностную экспрессию. 

Ученые выдвинули гипотезу о возможном механизме экспозиции Src на поверхности через аутофаголизосомальный экзоцитоз. Они предположили, что если внутриклеточный белок закреплен на мембранах фагофора — удлиненной структуры эндоплазматического ретикулума, из которой формируются аутофагосомы, — то при слиянии аутофагосом с клеточной мембраной тот белок, который был на внутренней мембране, будет экспонироваться снаружи клетки. 

Для проверки гипотезы исследователи вмешались в лизосомальный экзоцитоз — клетки HCC1569 обрабатывали вакуолином-1 или бафиломицином A1. Оба соединения снижали уровень Src на поверхности; ингибирование биогенеза экзосом или эндосомального экзоцитоза на него не влияли. Индукция аутофагии и лизосомального экзоцитоза с помощью траметиниба, напротив, повышала уровень этой киназы на поверхности. Также авторы выделили фракцию аутофагосом и подтвердили присутствие Src с помощью иммуноблота. 

Учитывая, что в раковых клетках повышена экспрессия Src и усилен лизосомальный экзоцитоз, авторы предположили, что поверхностный Src может служить опухолеспецифичным антигеном для нацеливания терапевтических антител. Они синтезировали и охарактеризовали антитело, специфичное к этому белку, и проверили, способно ли оно направленно связываться с опухолевыми клетками у мышей (антитело разработали для связывания Src человека, но оно обладало кросс-реактивностью к Src мыши). 

Анти-Src-антитело коньюгировали с дефероксамином — хелатором тяжелых металлов, — и получили комплекс этого конъюгата с изотопом циркония ⁸⁹Zr. Полученное соединение ввели мышам с подкожными опухолями, происходящими из клеток рака молочной железы мыши EMT-6, а затем отслеживали распределение метки с помощью позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ). Сигнал ⁸⁹Zr устойчиво и интенсивно локализовался в опухоли, сохраняясь до 168 часов. Введение 100-кратного избытка неконъюгированного антитела препятствовало накоплению метки в опухоли, но сигнал в других тканях не возникал. Аналогичные результаты авторы получили на двух других мышиных моделях. 

Наконец, ученые подтвердили клинический потенциал поверхностной формы Src. Они создали биспецифичные антитела, связывающие Src и CD3, которые обеспечили привлечение Т-клеток к опухоли, а также конъюгировали анти-Src-антитело с монометилауристатином Е (противораковым препаратом) и с радиолигандом. Все три варианта позволяли нацелить терапевтический агент на опухолевые клетки in vitro. Биспецифичное антитело, связывающее Т-лимфоциты, также протестировали на гуманизированных мышах. Его вводили иммунодефицитным животным с ксенотрансплантатом карциномы мочевого пузыря и человеческими CD8+ T-клетками. Препарат антитела ингибировал рост опухоли in vivo. 

Таким образом, усиленный экзоцитоз аутофаголизосом в раковых клетках и высокую экспрессию протоонкогенной киназы Src можно использовать для разработки таргетной терапии онкозаболеваний. Неканоническое экспонирование Src именно на поверхности раковых клеток способно обеспечить специфичность доставки с помощью препаратов на основе анти-Src-антител. 

Мутации в белке RAS способствуют подавлению активности онкосупрессора DLC1