Рестриктаза PaqCI для точной сборки Golden Gate

Бесшовная сборка, или клонирование, Golden Gate — это метод клонирования ДНК, при котором несколько фрагментов одновременно и упорядочено собираются в одну молекулу. Впервые этот метод был предложен в 2008 году учеными из немецкой компании Icon Genetics. Название метода отсылает к знаменитому мосту Золотые Ворота (Golgen Gate) в Сан-Франциско, который обеспечивает непрерывное («бесшовное») соединение улиц на обоих берегах пролива Золотые Ворота. Для сборки Golden Gate необходимы эндонуклеазы рестрикции типа IIS, которые имеют асимметричные сайты узнавания и вносят разрывы в последовательностях-мишенях за пределами этих сайтов. В сборке также участвует ДНК-лигаза T4.

Компания SkyGen — эксклюзивный дистрибьютор продукции New England Biolabs в России и СНГ. Эндонуклеазы рестрикции, реагенты для клонирования, ПЦР/ОТ-ПЦР/реал-тайм ПЦР, NGS-пробоподготовки, редактирования генома и многое другое. Для заказа обращайтесь на sales@skygen.com или по телефону 8 800 775 04 19

На данный момент NEB предлагает 50 эндонуклеаз рестрикции типа IIS, часть из которых прекрасно подходит для сборки Golden Gate. В качестве «рабочих лошадок» для сборки Golden Gate используются такие ферменты, как BsaI-HF®v2, BsmBI-v2 и BbsI-HF. Исторически сложилось так, что именно для них были опубликованы первые протоколы сборки, и их активно использовали исследователи. В это же время, в том числе и по просьбам исследователей, компания начала разработку фермента для сборки с сайтом узнавания длиной семь нуклеотидов, с полностью оптимизированным протоколом и другими рекомендациями, который бы подходил и для простых, и для сложных сборок, и при этом имел бы доступную цену.

Преимуществом эндонуклеаз рестрикции типа IIS с сайтом узнавания длиной семь нуклеотидов (Fig. 1) является то, что эти сайты с низкой вероятностью будут присутствовать в продукте сборки, поэтому они могут быть использованы для сборок любой сложности. В ходе совместной работы сотрудники лабораторий департаментов исследования, применения и производства NEB выделили и клонировали фермент PaqCI и подобрали оптимальные условия для его наработки. Кроме того, для фермента выбрали оптимальный ДНК-активатор и разработали протоколы для его использования как для простых вставок, так и для сборок разной сложности.

Значение PaqCI с точки зрения «одомашнивания»

Под «одомашниванием» понимают превращение фрагмента ДНК, который должен стать частью конструкции, в форму, подходящую для сборки Golden Gate: присоединение к обоим его концам сайтов рестрикции ферментов типа IIS (они будут задавать направление сборки), а также удаление внутренних сайтов, которые может распознать использующийся фермент. Длина сайтов узнавания большинства эндонуклеаз рестрикции типа IIS составляет шесть нуклеотидов. Однако с точки зрения статистики определенные последовательности длиной семь нуклеотидов будут встречаться в любой ДНК реже, чем шестинуклеотидные. Присутствие сайтов рестрикции внутри фрагментов сильно снижает эффективность сборки: в этом случае продукт сборки тоже будет содержать этот сайт, что приведет к ошибочной или нежелательной сборке.

Если сборка Golden Gate используется для внесения единственной вставки, наличие внутренних сайтов рестрикции не составляет проблемы, поскольку эффективность одиночных вставок и так довольно высока. Необходимый продукт сборки будет получен даже в том случае, если многие из успешно клонированных вставок перешли в линейную форму и не вошли в состав итогового продукта. Однако чаще исследователи используют сборку Golden Gate для множества вставок, и чем выше сложность сборки, тем большее значение имеет ее эффективность. По этой причине наличие внутреннего сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции во фрагментах ДНК препятствует правильной сборке.

Для удаления внутренних сайтов рестрикции во фрагментах ДНК в ходе «одомашнивания» существует два проверенных метода:

1. Сайт-направленный мутагенез, устраняющий внутренний сайт, что способствует эффективной сборке;

2. Внедрение точки сборки непосредственно во внутренний сайт узнавания с заменой основания, чтобы в продукте сборки сайт узнавания отсутствовал.

Однако «одомашнивание» последовательностей ДНК занимает много времени, и фермент с сайтом узнавания из семи нуклеотидов, для которого вероятность появления внутреннего сайта ниже, представляется более выгодным вариантом. Таким ферментом является PaqCI. Он продается в концентрации, которая позволяет использовать его для сложных сборок, включающих 20 и более фрагментов.

Как работают ферменты с несколькими сайтами узнавания и почему их работу улучшает ДНК-активатор

Некоторые ферменты взаимодействуют с сайтами рестрикции еще более сложным образом. Большинство гомодимерных ферментов рестрикции, таких как стандартные эндонуклеазы рестрикции типа IIP EcoRI и HindIII, состоят из двух идентичных субъединиц. Субъединицы кооперативно связываются в области симметричного сайта ДНК, после чего каждая из субъединиц разрезает одну цепь ДНК. В результате формируется двухцепочечный разрыв. У ферментов с несколькими сайтами узнавания, таких как PaqCI, структура и механизм работы более сложные. Предполагается, что PaqCI взаимодействует с двумя своими сайтами узнавания посредством нескольких субъединиц. Благодаря их работе он вносит разрыв в одном участке-мишени. Чтобы убедиться, что PaqCI разрезает все мишени при сборке Golden Gate, NEB поставляет фермент в комплекте с инертным коротким ДНК-олигонуклеотидом, который содержит дополнительный сайт узнавания PaqCI. Таким образом, этот фрагмент служит транс-активатором PaqCI (Fig. 2).

Cборка Golden Gate строится таким образом, что каждая вставка и каждая плазмида, в которую необходимо вставить фрагмент ДНК, имеет участок, задействованный в сборке и фланкированный двумя сайтами узнавания. Поэтому в дополнительных сайтах узнавания нет нужды. Однако Golden Gate — очень динамичный процесс, в ходе которого одновременно происходят акты разрезания и лигирования. Возникают ситуации, при которых PaqCI связывает и разрезает сайты на разных молекулах ДНК, и на каждой из них при этом остается неразрезанный сайт-мишень. ДНК-активатор PaqCI содержит оптимизированный набор дополнительных сайтов узнавания, и благодаря ему все реакции разрезания в ходе сборки проходят до конца. Важно отметить, что активатор не разрезается и никак не участвует в самой сборке, он просто предоставляет второй сайт узнавания, благодаря которому фермент вносит все необходимые разрывы.

Для сборок разной сложности необходимы разные количества PaqCI и ДНК-лигазы T4. Кроме того, количества PaqCI и активатора были тщательно оптимизированы в зависимости от числа фрагментов. Оптимальное количество активатора может отличаться от того, которое рекомендовано для стандартного разрезания ДНК с помощью PaqCI. Стандартная рекомендация предполагает использование 1 мкл активатора (20 пикомоль) на 1 мкл (10 U) фермента. Дело в том, что при стандартной рестрикции ДНК ферментом PaqCI разрезанная ДНК так и остается разрезанной, а при сборке Golden Gate перекрывающиеся концы фрагментов ДНК могут быть иначе отожжены друг на друга и лигированы, в результате чего может восстановиться исходный сайт узнавания. В последнем случае любой сайт разрезания ДНК в ходе сборки может быть разрезан более одного раза. В силу динамической природы сборки Golden Gate эти вновь созданные сайты переходят в меньшее количество вспомогательных сайтов, и для них необходим активатор.

Исследователи из NEB провели более тысячи тестовых сборок и рассчитали оптимальные количества PaqCI, активатора и ДНК-лигазы T4 для всех сборок, начиная от простых единичных вставок и заканчивая сложными сборками из 24 фрагментов (Табл. 1).

Таблица 1. Рекомендации для сборки Golden Gate с помощью PaqCI

Сложность сборки	PaqCI	ДНК-лигаза T4	Активатор PaqCI3
Клонирование с одной вставкой (10 минут при 37°C) или Library Prep (60 минут при 37°C)	5 U	200 U	+ 5 пикомоль (1/4 мкл от стокового раствора с концентрацией 20 мкМ)
Простая или средняя по сложности сборка1 (от 2 до 10 фрагментов)	5–10 U	200–400 U	+ 5 пикомоль (1/4 мкл от стокового раствора с концентрацией 20 мкМ)
Сложная сборка2 (от 11 до 20 и более фрагментов)	10–20 U	400–800 U	+ 5-10 пикомоль (1/4-1/2 мкл от стокового раствора с концентрацией 20 мкМ)

1. На основании тестовой сборки из 5 фрагментов.

2. На основании тестовой сборки из 24 фрагментов.

3. Активатор находится в буферном растворе без магния для лучшей сохранности при длительном хранении. Если есть необходимость в стоковых растворах, использующихся небольшое время, можно растворить необходимое количество активатора в 1X буфере для ДНК-лигазы T4, чтобы получить раствор, который нужно добавлять в легко пипетируемых объемах (например, четырехкратное разведение = 5 мкМ, 5 пикомоль/мкл активатора).

По мере возрастания сложности сборки для реакции требуется большее количество фермента: от 5 до 20 U PaqCI и 200–800 U ДНК-лигазы T4. Рекомендации по добавлению активатора варьируют от 5 до 10 пикомоль на реакцию. В комплекте с ферментом PaqCI поставляется стоковый раствор активатора концентрацией 20 мкМ.

Замечание по поводу буферов: для простого разрезания при помощи PaqCI рекомендован буфер rCutSmart Buffer, а для сборки Golden Gate для достижения наибольшей эффективности PaqCI и ДНК-лигазы T4 рекомендуется использовать буфер T4 DNA Ligase Reaction Buffer.

Инструменты для сборки Golden Gate от New England Biolabs

После того, как вы выбрали фрагменты ДНК для сборки, с помощью онлайн-инструмента от NEB Golden Gate Assembly Tool вы можете подобрать оптимальные четырехнуклеотидные перекрытия между вставками. Работа инструмента была независимо проверена в рамках исследований по подбору оптимальных условий для наивысшей точности ДНК-лигазы T4. Инструмент автоматически проверит ваши вставки на наличие внутренних сайтов узнавания, которые могут повлиять на выбор фермента типа IIS для вашей сборки, или сообщит пользователю о необходимости удаления этих сайтов через процедуру «одомашнивания». Программа также автоматически создаст набор праймеров для добавления к вашим вставкам фланкирующих оснований и сайтов узнавания, необходимых или для наработки ампликонов вставок, которые можно сразу использовать для сборки, или для процедур, предшествующих клонированию. Наконец, программа может создать отчет, описывающий вашу сборку целиком и содержащий цветные схемы, финальную последовательность продукта сборки и описания каждых соединений между вставками.

Наконец, в графе Utility интерфейса инструмента собраны другие полезные программы. Эти программы могут обработать загруженную последовательность и дать рекомендации для различных нужных вставок или создания модулей, а также предложат список перекрытий, которые были выявлены для наиболее эффективной сборки Golden Gate. Вместе с инструментом NEB Golden Gate Assembly Tool дизайн сборки станет простым даже для того, кто сталкивается с ней впервые!

Не только Golden Gate

Другой надежный метод упорядоченной сборки множества фрагментов ДНК — метод Гибсона — основан на действии трех ферментов: 5’-экзонуклеаза формирует длинные одноцепочечные «хвосты» с 3’-конца; полимераза достраивает одноцепочечные участки после отжига фрагментов друг на друга; лигаза сшивает фрагменты. Продукты линейки NEBuilder от NEB расширяют возможности стандартной сборки Гибсона. Среди преимуществ наборов NEBuilder — повышенная точность работы полимеразы, сниженные требования к минимальному количеству ДНК и возможность сшивки двухцепочечных фрагментов ДНК через одноцепочечный олигонуклеотид.

В России NEB представляет компания SkyGen.

Партнерский материал

Источник:

NEB Expressions 2021, Issue 2