Вакансия: Project manager (biotech)

Направленная вставка крупных фрагментов ДНК в геном остается нерешенной задачей генного редактирования. Недавно было показано, что с помощью сериновых рекомбиназ семейства IS110 («мостиковые рекомбиназы») можно редактировать протяженные участки генома. Теперь в Science вышла статья, посвященная применению мостиковой рекомбиназы для редактирования генома в клетках человека. Руководитель исследования — Мартин Йинек, соавтор знаменитой нобелевской статьи Дженнифер Дудны и Эмманюэль Шарпантье про CRISPR-Cas9. 

Вдохновившись первоначальным открытием мостиковых рекомбиназ, авторы статьи создали на их основе систему редактирования генома млекопитающих. Они использовали рекомбиназу ISCro4 из Citrobacter rodentium, которая обладала высокой активностью в клетках человека. Ученые разделили гидовые «мостиковые» РНК на отдельные петли связывания с таргетной и донорной ДНК (конструкция получила название split-bridge). 

Полученная система обеспечивала безопасную вставку участков длиной в несколько килобаз, а также направленные делеции и инверсии в известных локусах, связанных с заболеваниями. Ученые добились контролируемого внесения хромосомных делеций протяженностью до 1,6 килобаз, инверсий — до 800 пар нуклеотидов; частота рекомбинации в этих случаях превышала 10%. Длина направленных вставок, протестированных авторами, составила до 3,5 килобаз, а эффективность — более 6%. (Для сравнения — прайм-редактирование обеспечивает вставки в несколько десятков пар нуклеотидов, его модифицированные варианты — в несколько сотен.) Исследователи уточняют: они не оценивали максимальные размеры участка, который можно отредактировать с помощью ISCro4, но предполагают, что система сможет обеспечить перестройки генома до нескольких мегабаз. Авторы работы также охарактеризовали специфичность редактирования и нецелевую активность. Они пришли к выводу, что ISCro4 — перспективная основа для создания нового поколения инструментов геномного редактирования.

Система CRISPR-Cas широко применяется в генной инженерии, а теперь еще и для терапии наследственных заболеваний. Однако наиболее хорошо охарактеризованные Cas-белки — SpCas9 из Streptococcus pyogenes и AsCas12a из Acidaminococcus sp. BV3L6 — слишком велики, чтобы поместиться в аденоассоциированный вирусный вектор со всеми вспомогательными элементами, а разделение их на части снижает эффективность. Все больше внимания уделяется компактным Cas-белкам, включая AsCas12f1 из Acidibacillus sulfuroxidans (422 аминокислоты). Исследователи из США модифицировали AsCas12f1, чтобы повысить ее эндонуклеазную активность, и получили enAsCas12f, эффективность которой в 2–11 раз выше, чем у белка дикого типа.

Авторы повысили аффинность AsCas12f1 к нуклеиновым кислотам, заменив некоторые ее аминокислоты на положительно заряженные. AsCas12f1 вносит инделы в менее 20% таргетируемых сайтов, а enAsCas12f — до 69,8%. При этом размеры AsCas12f1 не превышают треть SpCas9. Активность AsCas12f1 была продемонстрирована на нескольких типах клеток человека. Увеличение эффективности нуклеазы не повысило ее нецелевую активность. Криоэлектронная микроскопия помогла получить структуру комплекса AsCas12f–гидРНК–ДНК с разрешением 2,9 Å. Гидовую РНК тоже оптимизировали, новая версия на 33% короче изначальной, но при этом обладает сопоставимой активностью.

Исследователи из Университета Осаки разработали технологию, упрощающую разделение нитей ДНК для нанопорового секвенирования. Их изобретение представляет собой платиновую наноспираль, окружающую нанопору в мембране из нитрида кремния (SiN_Х). Когда двунитевая ДНК достигает нанопоры, на нагреватель подается напряжение, и слабый нагрев бережно расплавляет ДНК. Эта концепция может быть полезной для секвенирования в твердотельных порах.

«Ключевое преимущество нового метода заключается в том, что нам не нужно нагревать весь образец, а только очень небольшую его часть, — объясняет первый автор Макусу Цуцуи. — Это означает, что для процесса требуется всего несколько милливатт мощности, повреждение ДНК сводится к минимуму, и мы можем считывать информацию с ДНК более точно».

Исследователи протестировали свой метод на ДНК фага лямбда длиной почти 50 т.п.н. и на более короткой кольцевой плазмиде pBR322. Новый подход позволял не только разделять цепочки ДНК, но и контролировать этот процесс, а также оценивать воздействие на движение ДНК электрических сил, сопротивления вязкой среды и температуры.

«Наше устройство должно быть простым в изготовлении, и мы надеемся, что оно станет базовой технологией для быстрого и точного секвенирования следующего поколения», — говорит руководитель работы Томодзи Каваи и добавляет, что оно хорошо подходит для использования в портативных диагностических приборах.

Спорная статья была опубликована в 2010 году. Фелиса Волф-Саймон из Геологической службы США, работая по гранту NASA, вместе с коллегами выделила из образцов калифорнийского озера Моно, вода которого содержит высокие концентрации мышьяка, бактерию, получившую наименование GFAJ-1. Анализ гена рибосомной 16S РНК показал, что она принадлежит к роду Halomonas, однако авторы статьи в Science сообщали, что в ее ДНК вместо фосфатов якобы содержатся арсенаты AsO₄^3–. Этот сенсационный результат сразу же был подвергнут жесткой критике. В частности, канадский микробиолог Розмэри Редфилд исследовала культуру GFAJ-1 и убедительно доказала, что мышьяка в ДНК бактерии нет.

Тем не менее статью отозвали  только сейчас. Главный редактор Science Холден Торп объясняет, что в те годы журнал отзывал в основном статьи, нарушающие этические нормы, однако сейчас могут быть отозваны и статьи, основные выводы которых не подтверждаются экспериментами. Это формальное действие особенно важно в связи с ростом популярности инструментов на основе ИИ.

Авторы статьи заявили, что  считают отзыв необоснованным: «Хотя наша работа могла быть написана и обсуждена более тщательно, мы считаем верными представленные данные».

В феврале 2025 года The New York Times опубликовала статью о Фелисе Волф-Саймон, карьера которой сильно пострадала после истории с мышьяковой ДНК: сейчас она получила краткосрочное финансирование для проведения новых исследований. После этого полемика вокруг статьи 2010 года возобновилась.

Среди научных интересов В.А. Гвоздева были регуляция экспрессии генов у эукариот, РНК-интерференция, мобильные элементы. Вместе с коллегами он впервые описал короткую РНК, вызывающую деградацию мРНК и позднее получившую название piРНК.

Интервью с Владимиром Алексеевичем Гвоздевым на PCR.NEWS: «Главное для ученого — любовь к науке и настойчивость»