3D-органоид нервной трубки поможет отследить раннее развитие ЦНС

Нервная трубка — это зачаток ЦНС, который представляет собой высокоорганизованную структуру. Анатомически в ней можно выделить две оси: рострально-каудальную (R-C), где на одном конце находится нос животного, а на другом — хвост, и дорсально-вентральную (D-V), где одна поверхность направлена вверх, а другая — вниз. В нервной трубке по этим осям формируются и развиваются разные отделы мозга, включая передний, средний и задний мозг, а также спинной мозг. До сих пор эти ранние этапы развития ЦНС изучались на животных моделях. Однако теперь международная группа ученых разработала 3D-органоид нервной трубки, используя микрофлюидные градиенты.

Основой модели стали человеческие эмбриональные стволовые клетки, которые выращивались в геле Geltrex. Авторы выбрали его потому, что этот гель содержит белки базальной мембраны и поэтому имитирует естественное окружение клеток в развивающемся организме. Органоид выращивали на специальном микрофлюидном чипе, в который по каналам подавали морфогены — различные вещества, стимулирующие дифференцировку клеток. Микрофлюидные каналы позволили формировать градиенты таких морфогенов.

Для начала ученые создали органоид, организованный по оси R-C. В качестве морфогенов они использовали FGF (факторы роста фибробластов), CHIR (активатор пути WNT) и ретиноевую кислоту. Соединения вносились в систему со второго по пятый дни культивации. Уже на седьмой день органоид начал организовываться в пространстве: ученые смогли обнаружить упорядоченные кластеры клеток, экспрессирующих OTX2 (маркер переднего и среднего мозга), HOXB1 (маркер заднего мозга), HOXB4 (маркер заднего и спинного мозга) и HOXC9 (маркер спинного мозга). В отсутствие морфогенов эти маркеры экспрессировались по всему органоиду без видимой пространственной организации. Ученые также оценили влияние каждого из морфогенов по отдельности, изменяя их количества либо ингибируя их фармакологически. В результате они выяснили, что путь WNT необходим для каудализации органоида, в то время как ретиноевая кислота и FGF обеспечивали правильную экспрессию генов HOX.

В организации нервной трубки по оси D-V участвуют BMP (костный морфогенетический белок) и WNT, которые способствуют формированию дорсальной поверхности, а также SHH и ретиноевая кислота, обеспечивающие образование вентральной поверхности. Сначала ученые получали органоид, организованный по оси R-C, а на пятый день инкубации формировали в нем антипараллельные градиенты морфогенов. После этого органоид начинал быстро расти, а на девятый день исследователи могли зарегистрировать характерные маркеры: SOX10 и PAX3 для дорсальной поверхности, NKX6 и OLIG2 для вентральной. При этом сохранялась организация по оси R-C. Полученный органоид выращивали вне микрофлюидного устройства вплоть до 21 дня. В нем сохранялась правильная пространственная организация зачатков регионов мозга, а также детектировались предшественники нейрональных клеток.

Ученые также провели транскриптомный анализ полученных органоидов с помощью секвенирования РНК единичных клеток. Они выявили десять выраженных клеточных популяций, включая клетки переднего, среднего, заднего и спинного мозга. С 9 дня культивирования органоидов в них появлялась популяция нейронов, которая активно разрасталась вплоть до 21 дня. Кроме того, исследователи сравнили полученные транскриптомные данные с транскриптомом человеческих эмбрионов на ранних стадиях развития и выявили многие сходства. Это доказало, что органоиды нервной трубки позволяют отслеживать развитие ЦНС на ранних стадиях.

Чтобы продемонстрировать потенциал применения органоидов нервной трубки в исследованиях, биологи провели несколько дополнительных экспериментов. В одном из них они отследили формирование нейромезодермальных предшественников, которые дают начало спинному мозгу и мезодерме. Такие клетки появлялись на каудальном конце органоида на четвертый день культивирования и исчезали на шестые сутки, что подтверждалось также данными транскриптомного анализа.

В другом эксперименте исследователи использовали органоид, чтобы отследить формирование нервного гребня. In vivo клетки нервного гребня берут начало в нервной пластинке, подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу, затем отделяются от дорсальной части нервной трубки и дают начало эктодерме и мезодерме. Важную роль здесь играет пространственное расположение — от него зависит путь дальнейшей дифференцировки клеток нервного гребня. Исследователи смоделировали этот процесс на органоиде, где формировались клетки нервного гребня, которые на разных стадиях развития образовывали сенсорные и симпатические нейроны, клетки Шванна и меланобласты. Вместе с тем ученые пронаблюдали, как нейромезодермальные предшественники дифференцировались в один из типов клеток нервного гребня. Это позволило исследователям предположить, что такой переход может происходить и в живых организмах.

С помощью предложенного метода ученые также получили органоиды переднего мозга, организованные по оси D-V. Такая организация важна для переднего мозга, так как из дорсальной поверхности образуются глутаматергические возбуждающие нейроны, а из вентральной — ГАМКергические тормозные нейроны. Для формирования пространственной структуры органоидов ученые использовали SAG (активатор пути SHH) либо ингибиторы SMAD, а затем непрерывно культивировали органоиды в условиях, подходящих для дифференцировки нейронов. Для образования оси D-V ученые вносили антипараллельный градиент BMP и SAG. На 40 день культивирования в органоиде появились нейрональные предшественники, а также стали заметны вентральная и дорсальная поверхности. Исследователи провели секвенирование РНК единичных клеток и обнаружили в органоиде девять популяций клеток. Несколько из них относилось к радиальной глии, а также предшественникам возбуждающих и тормозных нейронов. Транскриптом органоида переднего мозга вновь был похож на транскриптом эмбрионов на ранних стадиях развития.

Исследователи сообщили, что предложенная ими методика получения органоидов высокоэффективна и хорошо воспроизводима. Так, у них получалось повторять эксперименты с использованием разных линий стволовых клеток, а также индуцированных плюрипотентных клеток человека.

Новая методика получения 3D-органоидов нервной трубки особенно полезна для изучения нейрогенеза на ранних стадиях. Такие органоиды, полученные из человеческих стволовых клеток, позволяют исследовать этот процесс детально, что было невозможно с использованием животных моделей. Однако исследователи высказывают сомнения по поводу того, можно ли применять их органоиды нервной трубки для изучения дефектов развития, связанных с нарушением формирования нервной трубки.

Модель человеческого эмбриона возрастом две недели получена из стволовых клеток