Максим Карагяур об инструментах для изучения мозга человека

Новый блок «Мозг» на «Метафазе» открыл кандидат биологических наук Максим Карагяур, старший научный сотрудник Центра регенеративной медицины, доцент кафедры биохимии и регенеративной медицины ФФМ МНОИ МГУ лекцией «Молекулярные подходы, клеточные и животные модели для изучения функционирования мозга».

Развитие представлений о мозге

Лекция началась с обзора известных фактов о строении и функционировании мозга и истории развития этих представлений.

Мозг человека считается один из самых сложных известных объектов во Вселенной, отметил Максим Карагяур. Хотя масса головного мозга составляет всего 2% от массы тела человека, он потребляет до 20% всей энергии и кислорода. Мозг содержит около 100 млрд нейронов, соединенных более чем 100 трлн синаптических связей. В мозге экспрессируется около 7 000 генов (треть всех генов в геноме человека) и идентифицируется более 33 000 различных транскриптов — больше, чем в любом другом органе.

Одни из первых документальных упоминаний о мозге встречаются в древнеегипетских манускриптах. Впрочем, древние египтяне не понимали функций мозга, считали его наполнением для черепной коробки, хотя и фиксировали у отдельных больных неврологические нарушения, ассоциированные с повреждением мозга. Предположение о том, что мозг — один из жизненно важных органов, управляющих работой организма и собирающих информацию от органов чувств, первыми высказали греческие врачи и философы Гиппократ и Алкмеон Кротонский (V век до н.э.). Следующий скачок в развитии представлений о строении и функционировании нервной системы стал возможен лишь с развитием других областей науки — оптики и физики электричества. Благодаря этому Луиджи Гальвани в XVIII веке показал, что нервная и мышечная ткани являются электровозбудимыми. Работы Антони ван Левенгука, усовершенствовавшего микроскоп, открыли путь к изучению структуры нервной системы на микроскопическом уровне. Ряд открытий, имеющих важное значение для нейробиологии, произошел на рубеже в XIX-XX веков: Теодор Шванн описал клетки глии, а Сантьяго Рамон-и-Кахаль сформулировал нейронную теорию.

Что касается функционирования нервной системы, одним из первых безусловный рефлекс описал и механистически постарался его объяснить Рене Декарт. Условные же рефлексы были открыты И.П. Павловым, который заложил основу бихевиоризма. Принципы работы нервной системы на молекулярном уровне прояснили Эндрю Хаксли и Алан Ходжкин, которые открыли молекулярные механизмы электрической проводимости нервных волокон. Механизмы развития, нейропротекции и регенерации нервной ткани стали более понятны после открытия целого класса молекул (факторов роста) Ритой Леви-Монтальчини и Стэнли Коэном.

На сегодняшний день знания о структуре и функционировании головного мозга, равно как и о его развитии, достаточно обширны, хотя клеточные и молекулярные механизмы процессов высшей нервной деятельности (сознание, память, эмоции, сон и т.д.) остаются неизведанными. Существуют пробелы и в понимании механизмов регенерации и онтогенеза мозга, а также патогенеза нейродегенеративных и психиатрических заболеваний.

Модели мозговой ткани in vitro

Информацию о процессах развития, функционирования, обновления и регенерации головного мозга ученым позволяют получать in vitro и in vivo модели.

Одна из самых простых моделей для изучения головного мозга — это 2D культуры нейронов и клеток глии. В таких моделях клетки растут и взаимодействуют друг с другом в плоскости, однако не воспроизводят взаимодействие нейронов в трехмерном пространстве, что крайне затрудняет проецирование полученных в таких моделях данных на функционирование мозга в целом.

Более продвинутый тип клеточных моделей — 3D-культуры: переживающие срезы мозга, нейросферы, органоиды мозга и «мозг-на-чипе». Исторически первой 3D in vitro культурой мозга стали переживающие срезы мозга, то есть срезы отдельных участков мозга толщиной до 300 мкм, полученные от животного или от человека в ходе операции. Современные технологии позволяют поддерживать их в культуре в течение месяцев. Такие срезы мозга воспроизводят естественную архитектонику мозга и содержат все необходимые клеточные компоненты, что позволяет использовать их для изучения широкого спектра физиологических и патологических процессов, в том числе с применением электрофизиологических, иммунологических, генетических и фармакологических подходов.

К недостаткам применения переживающих срезов мозга можно отнести этические и технические сложности их получения, а также активацию микроглии и повреждение нервных связей при приготовлении срезов. На переживающих срезах мозга было получено множество данных о механизмах и роли клеток микроглии в процессах нейровоспаления, в частности, было показано, что они могут обладать как провоспалительной, так и нейропротективной активностью в отношении мозговой ткани.

Органоиды и сфероиды принципиально отличаются от переживающих срезов мозга тем, что они представляют собой самоорганизующиеся in vitro структуры. Их выращивают из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека или животных путем дифференцировки агрегата клеток в определенном направлении; в размере они могут достигать нескольких миллиметров. Такие модели могут быть получены из пациент-специфичных клеток, могут подвергаться генному редактированию и фармакологическим воздействиям. Органоиды позволяют устанавливать молекулярно-клеточные механизмы патогенеза неврологических заболеваний, связанных с нарушениями межклеточной коммуникации или клеточной миграции. Отдельные органоиды можно собирать в ассемблоиды, что позволяет отразить взаимодействие между различными отделами мозга или мозгом и органами.

Однако у 3D-культур есть и недостатки. Например, клетки в их центре трудно снабжать питательными веществами и кислородом, что приводит к их гибели с образованием некротического ядра. Из-за трудностей, связанных с созданием градиента метаболитов и индукторов, сложно получить асимметричные органоиды, которые, как и мозг, характеризовались бы передне-задней и дорсо-вентральной асимметрией. Кроме того, в органоидах часто присутствует только один тип нейронов, могут отсутствовать астроциты, олигодендроциты, микроглия и сосуды. Ввод сенсорной информации в такие структуры и регистрация их ответа тоже на сегодняшний день затруднены.

Тем не менее органоиды мозга позволили изучить молекулярные и клеточные механизмы некоторых заболеваний, к примеру, эпилептоидной энцефалопатии, вызванной мутацией в гене SCN8A, и синдрома удлиненного интервала QT 8 типа, вызванного мутацией в гене CACNA1C.

Отслеживать миграцию отдельных клеток внутри органоидов, а также содержание в них конкретных типов клеток можно с помощью генетически кодируемых флуоресцентных белков, экспрессия которых находится под контролем нейрон- или глияспецифичных промоторов. На рисунке ниже (панель слева) приведен пример типоспецифического мечения нейральных и глиальных клеток в составе нейроглиальных сфероидов.

Некоторые из флуоресцентных белков в составе реагируют на изменения концентрации внутриклеточного кальция (панель справа), что приводит к изменению спектра их флуоресценции. Это позволяет визуализировать спонтанные или вызванные деполяризации нейральных клеток в составе интактных и живых органоидов.

Слева — флуоресцентно меченные клетки в составе сфероидов: ГАМК-нейроны (экспрессия гена GAD2, зеленый цвет флуоресценции), глутаматергические нейроны (экспрессия гена SLC17A7, красный цвет) и олигодендроциты (экспрессия гена MAG, синий цвет). Справа — деполяризация в ГАМК-нейронах изменяет флуоресценцию сенсора

Более продвинутый вариант 3D-модели головного мозга — структура «мозг-на-чипе». Такие структуры сочетают в себе достижения микрофлюидных и клеточных технологий. На полимерной основе — чипе с микрофлюидными каналами для подачи питательных веществ и лекарственных препаратов, отвода метаболитов и т.д., —располагаются нужные популяции нейральных или ненейральных клеток. «Мозг-на-чипе» не только обладает всеми преимуществами органоидов, но и позволяет преодолеть некоторые из их ограничений, такие как невозможность создания градиентов питательных веществ, метаболитов и газов, невозможность создания асимметричных структур, невозможность ввода сенсорной информации. Однако широкому распространению этой технологии препятствуют высокая сложность и стоимость.

Модель «мозг-на-чипе» позволяет моделировать взаимодействие между клетками различных компартментов головного мозга или даже взаимодействие мозга с другими органами и тканями. Так, с помощью технологии «мозг-на-чипе» удалось in vitro смоделировать гипоталамо-гипофизарную ось, заселив отдельные камеры чипа нейронами гипоталамуса и клетками аденогипофиза и связав их самоорганизовавшейся сосудистой сетью из трансплантированных эндотелиоцитов. В результате исследователи могли наблюдать, как «гипоталамус» вырабатывал либерины, поступавшие по сосудистой сети в «аденогипофиз», что стимулировало синтез и секрецию в нем гормонов. При этом клетки «гипоталамуса» начинали экспрессировать рецепторы к гормонам аденогипофиза, формируя подобие физиологической отрицательной обратной связи.

Крайне любопытный пример использования технологии «мозг-на-чипе» — изучение влияния микробиоты кишечника на мозг. Комбинируя чипы, моделирующие кишечник (с заселенными микроорганизмами) и головной мозг, можно оценить каким образом отдельные штаммы микроорганизмов и продукты их метаболизма влияют на процессы развития и восстановления мозговой ткани, психоэмоциональное состояние и функционирование мозга.

Модель «мозг-на-чипе» позволяет смоделировать и гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который защищает мозговую ткань от токсинов и патогенов. Такая модель дает возможность изучать механизмы повреждения ГЭБ при различных патологиях, а также вести поиск фармакологических субстанций, способных проникать через ГЭБ или же менять его проницаемость.

Потенциал всех перечисленных моделей может быть усилен за счет сочетанного применения генетических технологий, включая системы редактирования генома. Такие подходы позволяют управлять экспрессионной активностью отдельных генов, метить целевые клетки и моделировать интересующие исследователей генетические варианты.

Информативность моделей можно усилить за счет привлечения омиксных технологий, позволяющих анализировать представленность отдельных генетических вариантов, эпигенетических модификаций, белков и метаболитов в динамике. Некоторые из этих подходов дают информацию на уровне отдельных клеток (например, scRNA-seq — секвенирование РНК одиночных клеток).

Животные — источник новой информации о мозге

Несмотря на колоссальный потенциал in vitro моделей, с их помощью невозможно моделировать и изучать сложные поведенческие и системные реакции: для этого необходимы животные модели.

В контексте изучения мозга самыми популярными модельными объектами являются дрозофила Drosophila melanogaster, рыбки Danio rerio, гладкие шпорцевые лягушки Xenopus laevis, грызуны (мыши, крысы) и приматы. Преимущества дрозофил — высокая скорость размножения и дешевизна содержания, однако их нервная система достаточно просто устроена (содержит всего около 100 тыс. нейронов), а сами они эволюционно далеки от человека. Danio rerio и лягушки Xenopus laevis быстро развиваются и имеют прозрачные эмбрионы, что облегчает изучение процессов развития. Оба этих вида просты в содержании и генетически ближе к человеку, хотя строение их мозга и мозга человека значительно отличаются, а поведение достаточно простое. Грызуны и приматы наиболее сходны с человеком, однако исследования на них затруднены по экономическим и этическим причинам, а также из-за длительного цикла размножения.

Все перечисленные животные также поддаются генетическим модификациям, что позволяет изучать вклад отдельных генов в процессы функционирования органов и тканей в физиологических и патологических условиях. Личиночные и эмбриональные стадии животных дают возможность изучать механизмы развития нервной системы, эффективность чего может быть значительно увеличена благодаря использованию технологий генетически кодируемых сенсоров и маркерных белков.

Животные модели — неотъемлемая часть комплексных исследований, ставящих своей целью установления роли конкретного гена или генетического варианта в развитии определенной патологии. Именно такой подход использовал в своих работах Максим Карагяур для поиска и установления функциональной значимости геномных вариантов, ассоциированных с развитием психических и когнитивных нарушений.

В рамках этого проекта ученые получили образцы крови пациентов, страдающих параноидной шизофренией и эндогенной депрессией. Двадцать один образец был подвергнут полноэкзомному секвенированию, которое идентифицировало более 220 однонуклеотидных геномных вариантов в 140 генах, вовлеченных в процессы морфогенеза головного мозга. Затем проанализировали распространенность некоторых идентифицированных однонуклеотидных геномных вариантов в выборках здоровых доноров и пациентов, страдающих психическими заболеваниями, с помощью одной из модификаций аллельспецифичной ПЦР. Некоторые из вариантов показали статистически значимые различия встречаемости между выборками здоровых доноров и пациентов, страдающих психическими заболеваниями.

Среди идентифицированных геномных вариантов авторы обратили внимание на полиморфизм rs1243306395 в гене Plau урокиназного активатора плазминогена — плейотропной молекулы, играющей важную роль в процессах ангиогенеза, миграции клеток (в т.ч. эндотелиальных, нейральных предшественников), прорастания нервных волокон, процессах созревания нейронных сетей и регенерации нервной ткани. Полиморфизм rs1243306395 локализован в области, кодирующей каталитический центр урокиназного активатора плазминогена и нарушает его ферментативную активности. Это, в свою очередь, может нарушать позиционирование нейральных предшественников в процессе закладки головного мозга в эмбриогенезе.

Когда данный геномный вариант смоделировали на мышах, их поведение изменилось по сравнению с контролем: повысились чувствительность к повторяющимся стрессовым воздействиям и склонность к самоповреждению, снизилась тревожность. Гистологический анализ мозга таких мышей выявил повышенную толщину коры головного мозга, что также может быть одним из признаков психических заболеваний.

Животные модели также можно использовать для разработки подходов к лечению социально значимых заболеваний со сложным комплексным патогенезом. Так, коллектив сотрудников МГУ под руководством докладчика изучает возможность применения продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) для стимуляции нейропротекции и подавления нейровоспаления у животных с моделированными инсультами и черепно-мозговыми травмами.

Согласно современным представлениям, МСК входят в число ключевых регуляторов и стимуляторов обновления и регенерации тканей человека. Они секретируют широкий спектр факторов роста, белков матрикса и противовоспалительных цитокинов. Предполагается, что такие белковые композиции могут защищать мозговую ткань от последствий различного рода повреждений, в первую очередь от нейровоспаления, которое способствует отсроченному и прогрессирующему повреждения мозговой ткани. Результаты исследований показали, что введение секретома МСК снижает выраженность нейровоспаления в гиппокампе крыс после черепно-мозговой травмы.

Секретом МСК увеличивал выживаемость экспериментальных животных с внутримозговым кровоизлиянием (модель геморрагического инсульта), снижал тяжесть неврологических нарушений и уменьшал объем поражения головного мозга по данным МРТ. Совокупность полученных данных дает основания полагать, что секретом МСК представляет собой перспективную терапевтическую композицию, которая может быть рекомендована в качестве платформы для разработки препаратов, направленных на терапию острых повреждений мозговой ткани. Эти данные невозможно было бы получить без использования генетически и морфологически близкой экспериментальной животной модели.

В заключение Максим Карагяур упомянул ряд развивающихся перспективных методов изучения функционирования мозга in vivo. Например, мечение нервных клеток с помощью ретроградно мигрирующих красителей (от окончания аксона к основанию) позволяет прослеживать путь нервных волокон, картировать аксоны и тела нейронов. Эта же задача отчасти может быть решена и на живом мозге человека с использованием диффузионно-тензорной томографии (разновидности МРТ), которая дает возможность отслеживать направление движения молекул воды по нервным волокнам и таким образом идентифицировать проводящие пути мозга.

Методы оптогенетики и хемогенетики предполагают введение в целевые клетки генетических конструктов, экспрессирующих чувствительные к свету или химическим воздействиям белки, активностью которых можно управлять с помощью света или химических индукторов. Это открывает новые горизонты управления активностью и даже программирования in vitro 3D моделей (с помощью облучения светом определенной длины волны или внесения специфических химических соединений).

В перспективе, предположил докладчик, будут применяться все более сложные и комплексные подходы к изучению мозга, с использованием пациентоспецифических клеток и генетических технологий, открывающие возможности для всестороннего и многофакторного анализа происходящих в нейронных сетях процессов. Хотя это потребует вложения значительных средств, результаты таких исследований откроют дорогу к развитию перспективных технологий замещения или стимуляции регенерации нервной ткани после повреждения, позволят разработать подходы к замедлению старения и нейродегенерации мозга, а также, возможно, послужат мощным драйвером роста технологий нейроинтерфейсов.