Анализ внеклеточных везикул в моче помогает диагностировать заболевания почек

В Японии разработали тестовую систему, анализирующую содержание четырех трансмембранных белков во внеклеточных везикулах, которые выделяются вместе с мочой. Тест успешно идентифицирует снижение почечной функции при хронической болезни почек у детей; возможно, у него есть потенциал для диагностики заболевания до снижения почечной функции.

Изображение:

Три почечных биомаркера, MGAM, MUC1, CD9, расположенные в разных клеточных компартментах и в разных сегментах нефрона, показаны соответственно зеленым, синим или красным цветом (флуоресцентное иммуноокрашивание).

Credit:

iScience, 2022. DOI: 10.1016/j.isci.2022.105416 | Пресс-релиз

Хроническую болезнь почек (ХБП) у взрослых вызывают разнообразные факторы. У детей, однако, ХБП чаще всего развивается из-за врожденных аномалий и генетических заболеваний. При этом детская ХБП характеризуется высокой смертностью. Группа ученых из Японии представила новую систему для диагностики детской ХБП на основе анализа белков во внеклеточных везикулах.

Внеклеточные везикулы (EV) — пузырьки из двухслойной липидной мембраны, выделяемые клетками организма в окружающую среду. Внеклеточные везикулы мочи (uEV) несут клетко-специфичные белки из всех сегментов нефронов и представляют собой богатый источник биомаркеров почечных патологий.

Первым делом необходимо было разработать способ изоляции везикул. Существующие методы или слишком избирательны и не позволяют изолировать все типы uEV, или же недостаточно надежны и могут повредить везикулы. Ученые разработали систему на основе Т-клеточного мембранного протеина 4 (TIM-4). TIM-4 связывается с фосфатидилсерином, содержащимся в мембране везикул. Так как образующаяся связь является Ca2+ зависимой, добавление агентов, хелатирующих Ca2+ , легко освобождает связанные везикулы. Функциональность системы была проверена на трех контрольных образцах, при этом удалось идентифицировать 1298 белков uEV.

На следующем этапе исследовали uEV, полученные от пациентов с билатеральной почечной гипоплазией — заболеванием, которое характеризуется врожденным малым размером почек и малым количеством нефронов. Ученые идентифицировали изменения в уровне содержания 135 белков — для 35 оно возросло, для 100 снизилось. Анализ идентифицированных белков при помощи многомерного шкалирования по уровню экспрессии позволил отделить пациентов с гипоплазией от контрольной группы. Белки с повышенной экспрессией оказались ассоциированными с иммунными сигнальными путями — это может указывать на хроническое воспаление в почках пациентов с ХБП. Белки с пониженной экспрессией были ассоциированы с трансфером электролитов.

Далее авторы работы изучили связь экспрессии идентифицированных белков с функцией почек. В качестве индикатора нарушений функции использовали расчетную скорость клубочковой фильтрации (eGFP). Для этого анализа ученые также включили в исследование данные от пациентов с ХБП, вызванным врожденными аномалиями, а не билатеральной гипоплазией. Консенсусная кластеризация на основе экспрессии 135 белков разделила образцы на две группы — со средним eGFP около 99 (соответствует нормальной функции почек) и средним eGFP около 46 (серьезное нарушение). Следовательно, анализ uEV можно применять и для диагностики нарушения почечной функции.

Ученые также обнаружили связь повышенного содержания креатинина в моче (один из индикаторов заболеваний почек) с уменьшением размеров uEV.

Затем авторы сконструировали диагностическую панель на базе иммуноферментного анализа. Панель измеряет содержание четырех мембранных белков, содержащихся в uEV. MUC1 и MGAM входят в число 135 белков, идентифицированных первичными тестами; CD9 и CD63 были включены как маркер типа везикул. Для пилотного исследования модели белки выбирали по доступности коммерческих антител к ним. Ученые показали, что как минимум три цикла заморозки образцов мочи и месяц хранения в замороженном виде не влияют результаты работы панели.

Тестирование панели провели на 94 педиатрических пациентах с ХБП и 26 контрольных образцах. Корректно были идентифицированы 100% образцов со значительным снижением функции почек (eGFR<60) и 95,3% — со слабым снижением функции (eGFR<90). При попытке отличить больных с нормальной функцией почек (eGFR>90) от контрольной группы удалось достичь корректной идентификации в 75% случаев, таким образом, анализ uEV может выявить ХБП еще до снижения функции почек.

Наконец, ученые проверили потенциал минимального варианта — оценки отношения экспрессии MGAM к MUC1 — для идентификации снижения почечной функции. Корректной идентификации удалось достичь для 92,2% образцов с eGFR<90. Чувствительность анализа составила 88,5%, специфичность 87,5% — точность анализа существенно выше, чем у существующих биомаркеров.

Ученые считают внеклеточные везикулы мочи перспективными маркерами для неинвазивной диагностики заболеваний почек и рекомендуют проведение дальнейших исследований на более широком спектре заболеваний.


Осведомленность о генетическом факторе риска хронической болезни почек может замедлить ее прогрессирование

Источник

Takizawa K., et al. Urinary extracellular vesicles signature for diagnosis of kidney disease // iScience 105416, published November 08, 2022. DOI: 10.1016/j.isci.2022.105416

Добавить в избранное