Аутотрансплантация лимбальных стволовых клеток лечит химические ожоги глаз

Лимбальные стволовые клетки (ЛСК) располагаются между роговицей и конъюнктивой и дифференцируются в прозрачный эпителий роговицы. Нарушение функции или снижение численности ЛСК (например, вследствие химического ожога) вызывает различные патологии глаза, включая нарастание конъюнктивы на роговицу, эпителиальные дефекты, неоваскуляризацию, воспаление. Традиционные методы трансплантации роговицы не обеспечивают восстановление популяции ЛСК, а трансплантация донорских ЛСК несет высокий риск как для реципиента, так и для донора. Уже в XX веке разрабатывались методы трансплантации культивированных ЛСК, однако эти методы используют мышиные клетки и фетальную бычью сыворотку, что также сопряжено с рисками и препятствует одобрению метода в ряде стран. Группа под руководством исследователей из Гарвардской медицинской школы представила результаты доклинических исследований метода культивации ЛСК, который не требует животного биоматериала.

ЛСК для культивации отбирали с помощью биопсии из здорового глаза пациента. Первичная культивация проводилась на плашках, после чего клетки пересаживали на деэпителизированную амниотическую мембрану марки AmnioGraft. Натуральные криоконсервированные амниотические мембраны активно используются в офтальмологии при терапии патологий роговицы. Сформированный и готовый к пересадке конструкт (названный CALEC — cultivated autologous limbal epithelial cells) представляет собой равномерный слой клеток на мембране.

Анализ клеточных маркеров до пересадки клеток на мембрану показал высокий (~95%) уровень экспрессии эпителиальных маркеров (CD49F и CD340) и низкие уровни экспрессии лейкоцитарных/эндотелиальных маркеров (CD45/CD31; 3,9%) и мезенхимальных маркеров (CD13; 6,4%).

Жизнеспособность клеток в финальном конструкте оценивали при помощи этинилдезоксиуридина (нуклеотид, встраивающийся в ДНК делящихся клеток и используемый как маркер пролиферации) и коммерческих наборов; 83±1% клеток идентифицировались как живые и 25±2% клеток активно синтезировали новую ДНК. Окрашивание подтвердило присутствие маркеров стволовых клеток. Для транспортировки CALEC в клинику выбрали погружение в среду HypoThemosol при 2-8°C в течение всей перевозки.

Доклинические испытания конструктов провели на четырех пациентах с химическими ожогами глаза различной природы. Для пятого пациента не удалось получить качественную биопсию, для одного из четырех биопсия была получена только со второго раза.

У двух пациентов трансплантация CALEC устранила эпителиальные дефекты и неоваскуляризацию, что позволило провести трансплантацию роговицы для восстановления зрения (так как у этих пациентов сохранялось замутнение роговицы). Клинические эффекты трансплантации оценивались вплоть до 12 месяцев после операции.

У двух других пациентов, кроме устранения эпителиальных дефектов, удалось добиться значительного улучшения зрения. У одного пациента до трансплантации была острота зрения 20/40 по таблице Снеллена, после — повысилась до 20/30. (Таблица Снеллена — наиболее распространенный в странах с латинским алфавитом метод проверки остроты зрения; отечественный аналог — таблица Д.А. Сивцева, «ШБ МНК»; результат 20/30 означает, что человек видит с расстояния 20 футов, то есть около 6 м, строчку, которую человек с нормальным зрением может увидеть с 30 футов.) Второй пациент до операции мог распознавать движение рук, но посчитать пальцы на руке не был способен; и у него была достигнута острота зрения 20/30.

Весь процесс изготовления конструкта, от биопсии до готового продукта, занимал от 13 до 22 дней. Примечательно, что клетки от одного из пациентов не формировали колонии in vitro, но пролиферировали после высадки на мембрану. Финальное количество клеток на конструкт составило 0,8±0.2 × 10⁶ клеток.

Таким образом, первая фаза исследований показала клиническую эффективность разработки без существенных побочных эффектов. Авторы планируют продолжение исследований CALEC на большей когорте пациентов с удлинением периода наблюдения до 18 месяцев.

Клетки эндотелия роговицы, полученные из стволовых клеток, заменят пересадку кадаверных тканей