CAR-T-клетки в организме пациента приобретают характерную транскриптомную сигнатуру

Рецидивы острого лимфобластного лейкоза остается ведущей причиной детской смертности, несмотря на интенсивную химиотерапию, часто включающую аллогенную трансплантацию костного мозга. При рецидивирующем и резистентном к терапии пре-В-клеточном остром лимфобластном лейкозе (CD19+ B-ALL) у детей часто вызывают стойкие ремиссии CD19-таргетные CAR-Т-клетки. Но для этого они должны циркулировать в организме продолжительное время. Авторы статьи в Nature Medicine изучили молекулярные особенности персистирующих CAR-Т-клеток, используя высокопроизводительное секвенирование РНК единичных клеток и секвенирование Т-клеточных рецепторов.

В исследование вошли 15 пациентов с высоким риском рецидивирующего CD19+ B-ALL, получавшие СD19 CAR-T терапию в ходе клинического испытания CAPRALL. CAR-T-клетки для анализа выделяли из криоконсервированных образцов крови или костного мозга. Тринадцать из 15 (87%) пациентов достигли полной ремиссии; у шести пациентов позднее развился рецидив, в то время как у остальных семи ремиссия оказалась длительной; у этих семи пациентов выявлялись CAR-T-клетки и отсутствовали В-клетки.

Для образцов 11 детей авторы провели подробное фенотипирование методом проточной цитометрии, у десяти детей было получено достаточное количество CAR-T клеток для секвенирования мРНК и Т-клеточных рецепторов (TCR) единичных клеток. Образцы отбирали в три временных промежутка: ранний (1–3 месяца после CAR-T-терапии), средний (4–6 месяцев) и поздний (7 месяцев и более).

Контроль качества прошли около 265 тысяч единичных клеток, из которых около 50 тысяч были CAR-T-клетками. Транскрипционные профили CAR-T клеток в разных временных точках различались, следовательно, изменялась экспрессия генов. Интересно, что пролиферирующие клетки были обнаружены во всех временных точках; CAR-T-клетки продолжали делиться в течение нескольких лет после инфузии. Во всех временных точках, за исключением поздних, преобладали CD8+ T-клетки. В поздние сроки в CAR-T-клетках отсутствовала экспрессия CD4 и CD8A, иными словами, популяция CAR-T-клеток состояла преимущественно из дважды отрицательных Т-клеток.

Авторы подтвердили раннее преобладание CD8+ Т-клеток и позднее появление дважды негативной популяции (СD4- CD8-) с помощью двух подходов. В рамках первого подхода образцы периферической крови и костного мозга собрали у семи пациентов в поздние сроки (от 7 месяцев до шести лет после инфузии CAR-T-клеток). Проточный цитометрический анализ показал, что большинство CAR-T-клеток были дважды отрицательными, а меньшая часть имела рецепторы CD8. Кроме того, CAR-T-клетки демонстрировали отсутствие экспрессии CD45RA и CCR7, что свидетельствует о фенотипе эффекторных клеток памяти.

Второй подход заключался в сравнении транскриптомов CAR-T-клеток с комплексным атласом единичных клеток иммунной системы человека, включающим данные по 211 тысяче мононуклеарных клеток крови. Он дал сходные результаты: большинство персистирующих CAR-T-клеток позднего периода были дважды отрицательными, в то время как CAR-T-клетки из более ранних временных точек были преимущественно CD8+ T-клетками.

Далее авторы определили дифференциально экспрессируемые гены среди CAR-T-клеток из каждой временной точки, чтобы выделить маркеры еще не введенных СAR-T клеток в инфузионном препарате, а также персистирующих ранних, средних и поздних CAR-T-клеток. Клетках до инфузии были обогащены гены, связанные с клеточным циклом, сборкой нуклеосом и гликолизом, что, вероятно, связано с их активацией in vitro в процессе производства. Также экспрессировались гены, ассоциированные с наивными лимфоцитами и ранним статусом дифференцировки клеток памяти. Постинфузионные CAR-T-клетки активно экспрессировали гены, связанных с продукцией гранзимов (белковых токсинов, убивающих раковые клетки).

Сигнатура поздних CAR-T клеток характеризовалась экспрессией генов, связанных с иммунным ответом, таких как TIGIT и GPR183. Ведущим маркером оказался FXYD2, кодирующий модулятор канала Na+/K+ АТФазы. Поздние CAR-T-клетки также экспрессировали рецепторы, ассоциированные с истощением, включая HAVCR2 и LAG3, но в меньшей степени PD-1. При этом они не выглядели терминально дифференцированными, в частности, экспрессировали низкий уровень B3GAT1 (CD57), и каждая клетка экспрессировала не более двух маркеров истощения. В отличие от CAR-T-клеток в инфузионных препаратах, поздние CAR-T-клетки не экспрессировали в больших количествах TCF7, управляющего стволовостью, но активно экспрессировали транскрипционный фактор JUN, способный обращать вспять истощение и поддерживать существование клеток со свойствами стволовых клеток памяти.

Авторы проверили, не обусловлено ли транскриптомное единообразие поздних CAR-T-клеток экспансией определенных клонов, но секвенирование Т-клеточных рецепторов подтвердило, что «генофонд» CAR-T-клеток остается разнообразным, и не обнаружило доминирования определенных клонов в поздних временных точках. Количество CAR-T-клеток с течением времени снижалось и в поздние сроки составляло всего 0,05% от общего числа CD3+-клеток в кровотоке. Возможности отслеживания отдельных клонов ограничивало высокое разнообразие, но ученые все же установили, что 10 наиболее представленных клонотипов на ранних временных точках оставались относительно преобладающими, однако со временем их частота снижалась.

Учитывая схожесть транскрипционных сигнатур в CAR-T-клетках у разных пациентов, авторы проверили, появляется ли «сигнатура персистенции» у других продуктов для CAR-T-терапии. Действительно, когда они проанализировали данные двух взрослых пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом, то обнаружили значительное сходство. В заключение ученые показали, что эта сигнатура не встречалась ни в здоровых тканях, ни в клетках других типов рака.

Таким образом, CAR-T-клетки, длительно сохраняющиеся в организме пациента, развивают двойной отрицательный фенотип по CD4 и CD8, приобретают черты сходства с истощенными клетками памяти и уникальный транкриптомный паттерн. Возможно, этот результат позволит заранее оценивать клиническую эффективность CD19 CAR-T-клеток, связанную со способностью длительное время сохраняться в организме.

Универсальные CAR T-клетки против миеломы могут конкурировать с индивидуальными продуктами