Что нужно тритону, чтобы отрастить конечность

Тритоны отличаются от большинства хвостатых земноводных способностью отращивать утерянные конечность, в том числе неоднократно. Эта способность сохраняется и после метаморфоза. Японские ученые исследовали восстановление мышц при регенерации конечностей у огненнобрюхого тритона Cynops pyrrhogaster.

Ранее те же авторы установили, что в регенерации конечности у тритона до завершения метаморфоза (превращение из личинки, дышащей жабрами, во взрослую амфибию) используются стволовые клетки-предшественники, а после метаморфоза, в возрасте года-полутора регенерацию обеспечивают мышечные клетки культи, которые дедифференцируются в миогенные клетки. Последнее отличает тритона от других амфибий, которые после превращения регенерировать конечности не могут. Однако оставалось неясным, какой процесс регулирует дедифференцировку — метаморфоз или рост тела.

Для наблюдения за клетками мышечных волокон исследователи разработали систему на основе экспрессии флуоресцентных белков EGFP и N-mCherry. С помощью CRISPR-Cas они создали тритонов-альбиносов, в которых удобно наблюдать флуоресценцию, получили от них яйцеклетки и трансформировали их кассетой для экспрессии зеленого EGFR и красного mCherry. В отсутствие рекомбинации по сайтам LoxP, которыми окружен ген EGFP, в клетках экспрессируется EGFP. В составе этой же экспрессионной кассеты находится ген, кодирующий рекомбиназу Cre. Ее экспрессия запускалась добавлением тамоксифена, после этого рекомбиназа удаляла ген EGFP и запускалась экспрессия гена mCherry, стоящего после него: клетки скелетных мышц начинали светиться красным. Это позволяло отслеживать их судьбу во время регенерации.

В новом исследовании они сравнили тритонов с обычным развитием и гигантских личинок тритона, у которых метаморфоз был заблокирован добавлением тиомочевины.

Когда ученые специфически индуцировали рекомбинацию в многоядерных мышечных волокнах с помощью 4-гидрокситамоксифена (4-OHT), в результате чего от 17 до 42% всех ядер в мышечных волокнах начинали экспресссировать только N-mCherry. Сателлитные клетки, также присутствующие в мышцах, никогда не экспрессировали N-mCherry, поэтому все ядра, которые были визуализированы, принадлежали только многоядерным миоцитам.

Ученые отследили перемещения ядер мышечных волокон в область бластемы, то есть регенерирующей конечности. Хотя передние лапки у гигантских личинок отрастали столь же успешно, у них не происходила дедифференцировка мышечных волокон и нарушался процесс формирования пальцев. В ходе метаморфоза у этих личинок восстанавливалось нормальное формирование пальцев и наблюдалась дедифференцировка мышечных клеток, как и у обычных взрослых тритонов.

Исследователи отметили, что дедифференцировка мышц происходила только у особей, длина тела которых превышала 6 см. Тритоны достигают такого размера примерно к 1,1 года, однако рост можно искусственно замедлить, понизив температуру воды с предпочтительной (18–20 °C) до низкой (12 °C). Авторы работы показали, что у тритонов, содержащихся в холодной воде, после удаления конечности дедифференцировки мышечных волокон при регенерации не происходило — она начиналась, только когда тритоны дорастали до 6,5 см.

Таким образом, для успешной дедифференцировки мышечных волокон, обеспечивающей регенерацию лапки, тритону необходимы как прохождение метаморфоза, так и достижение определенной длины тела, то есть рост. Наиболее разумным объяснением механизма, отвечающего за этот путь регенерации, авторы считают изменения микроокружения, или «ниши» стволовых клеток, подавляющие их участие.

Регенерация конечности ксенопуса в биореакторе