Для целевого редактирования РНК нужна всего одна молекула

Китайские ученые приспособили эндогенные деаминазы ADAR для направленного редактирования РНК. Новая технология LEAPER (leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA) не требует вводить фермент в клетку — нужна только специфическая РНК, привлекающая ADAR.

Изображение:

Кристаллическая структура каталитического домена человеческого ADAR2, взаимодействующего с двухцепочечной РНК с аналогами аденозина | 

Credit: WhatshouldIdo, CC BY-SA 4.0 | https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=56340974

Последнее время активно развиваются не только технологии редактирования ДНК, но и РНК. Для этого, в частности, можно использовать фермент ADAR — в двухцепочечной РНК он дезаминирует аденозин с образованием инозина, который при трансляции ведет себя как гуанин. Специфичность же достигается присоединением деаминазы к dCas13 с гидРНК (dCas13, в отличие от других CRISPR-ассоциированных белков, не разрезает цепочку нуклеиновой кислоты) или к другим белкам. Именно так устроены системы редактирования РНК, разработанные группой Фэна Чжана в Институте Брода: REPAIR (замена A на I) и недавно предложенная RESCUE (замена C на U, причем используется фермент ADAR2, превращенный с помощью направленного мутагенеза в цитидиндеаминазу). Однако необходимость экспрессировать в клетке и фермент, и гидРНК влечет за собой ряд ограничений и нежелательных эффектов.

Оказалось, что введения в клетку только гидРНК достаточно для редактирования транскрипта, поскольку их двухцепочечный комплекс активирует эндогенный ADAR. (В естественных условиях эти ферменты, редактирующие РНК, участвуют в регуляции трансляции.) Такая гидРНК в новой системе LEAPER получила название ADAR-привлекающая РНК (апРНК). Вводить в клетку ее можно как синтетический олигонуклеотид либо в виде кодирующей последовательности в плазмиде или вирусном векторе. Эффективность редактирования сильно зависит от длины апРНК и окружения редактируемого нуклеотида — последнее было успешно использовано для устранения нецелевого редактирования. Максимальная эффективность достигала 80%, впрочем, в большинстве экспериментов она не превышала 50%.

Технология LEAPER успешно работает в разных клеточных линиях, а коэкспрессия различных апРНК позволяет редактировать несколько сайтов одновременно. При этом введение апРНК не вызывает РНК-интерференцию и иммунный ответ, не влияет на нормальное функционирование ADAR и не приводит к редактированию нецелевых транскриптов.

Ученые проверили систему на клинически важной мутации в гене-супрессоре опухолей TP53, который экспрессирует p53. Экспрессия полноценного p53 была восстановлена.

Наконец, LEAPER применили для лечения моногенетического заболевания — синдрома Гурлер, наиболее распространенного подтипа мукополисахаридозов типа I. Болезнь вызвана мутацией в гене IDUA, из-за которой белок IDUA (альфа-L-идуронидаза) неактивен. Введение апРНК в фибробласты пациента частично восстановило активность белка (эффективность редактирования составила 30%). Чтобы понять, насколько это повлияло на болезнь, ученые сравнили восстановленную активность с таковой при синдроме Шейе — более мягком типе мукополисахаридоза, при котором альфа-L-идуронидаза малоактивна. Активность в редактированных клетках была примерно в полтора раза больше, что указывает на терапевтический потенциал LEAPER.

Эффективность и специфичность системы можно совершенствовать и дальше, но уже сейчас она имеет ряд важных преимуществ: небольшой размер апРНК, примерно такой же, как при РНК-интерференции, однако здесь речь идет о целевом редактировании, а не о деградации всей РНК. Использование же эндогенного ADAR не только упрощает систему, но и снижает неспецифичность, вероятность возникновения иммунного ответа и онкогенность.

Источник

Qu, L.,et al. // Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs // Nature Biotechnology, 2019; DOI: 10.1038/s41587-019-0178-z

Добавить в избранное

Вам будет интересно