ДНК митохондрий отредактировали с помощью бактериального токсина

Редактирование митохондриальной ДНК (мтДНК) с помощью системы CRISPR-Cas9 проблематично, поскольку доставка гидовой РНК в митохондрию сильно затруднена. В новой статье, опубликованной в Nature, ученые из США описали принципиально новый метод редактирования мтДНК, основанный на использовании бактериального токсина с цитидиндезаминазной активностью.

В основу новой системы редактирования лег токсин, названный учеными DddA, который производит бактерия Burkholderia cenocepacia. DddA представляет собой цитидиндезаминазу, работающую с двухцепочечной ДНК. В природе B. cenocepacia использует DddA как средство конкуренции с другими бактериями, выделяя токсин во внешнюю среду через специальную систему секреции.

Исследователи сконструировали варианты DddA, разделенные на две половины по остатку глицина G1333 или G1397, каждая из которых нетоксична и остается неактивной до момента взаимодействия с другой половиной. К каждой из двух половин присоединили домен TALE, который можно запрограммировать на распознавание определенной нуклеотидной последовательности. (Благодаря домену TALE свою последовательность-мишень узнают нуклеазы TALEN — инструмент для редактирования генома, появившийся незадолго до CRISPR-Cas.) Также к N-концу химерной молекулы TALE-DddA присоединили ингибитор урацилгликозилазы (UGI), который дополнительно увеличивает эффективность редактирования. Когда последовательность-мишень распознается доменами TALE двух половин токсина DddA, то половины DddA взаимодействуют друг с другом и образуют функциональную цитидиндезаминазу, которая заменяет пару CG на TA в нужном месте.

Сначала систему опробовали на редактировании ядерной ДНК клеток линии U2OS, причем доставка редактирующей системы в ядро происходила за счет двухчастного сигнала ядерной локализации, входящего в состав домена TALE. Использование доменов TALE с сигналом митохондриальной локализации в виде химерной молекулы с половинами DddA первоначально не дало результата, поскольку химерные молекулы, составляющие редактирующие комплекс, не перемещались в митохондрии, а оставались в цитоплазме. Чтобы система редактирования поступала в митохондрии, потребовалось добавить к ней линкерный участок из двух аминокислотных остатков, а для повышения эффективности редактирования перенести домен UGI с N-конца на C-конец. Итоговый редактирующий комплекс имел следующий вид (функциональные участки перечислены в направлении от N-конца химерного белка к C-концу): сигнал митохондриальной локализации — TALE — линкер из двух аминокислотных остатков — половина DddA — домен UGI. Авторы назвали его DdCBE от англ. DddA-derived cytosine base editor. Систему опробовали на пяти митоходриальных генах: MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 и MT-ATP8, причем эффективность редактирования составляла от 4,6% до 49%, а редактирование целевой последовательности происходило в 150–860 раз чаще, чем нецелевых участков мтДНК.

Авторы отмечают, что для оценки терапевтического потенциала DdCBE в лечении митохондриальных болезней еще предстоит провести исследования на разных линиях клеток и на животных моделях. Кроме того, возможно, DdCBE найдет применение и в редактировании ДНК других органелл.