ДНК-вольтметр для органелл

Исследование мембранного потенциала в большинстве внутриклеточных органелл затруднено из-за отсутствия подходящего инструментария. Авторы новой работы, опубликованной в Nature Nanotechnology, описали флуоресцентное ДНК-наноустройство для неинвазивного специфического измерения мембранного потенциала в живой клетке.

Устройство получило название Voltair и представляет собой ДНК-зонд длиной 38 пар оснований, несущий флуоресцентную репортерную систему. Voltair состоит из трех функциональных модулей. Первый модуль (D_v) выполняет функцию репортера и представлен одной цепью ДНК, конъюгированной на 3’-конце с чувствительным к напряжению флуоресцентным красителем (RVF). Второй модуль (D_A) — это вторая цепь ДНК, к 5’-концу которой прикреплен эталонный флуорофор (Atto647N), который нечувствителен к мембранному потенциалу и pH и обладает высокой фотостабильностью. Этот флуорофор используется в системе в качестве референса, с его помощью корректируются отклонения сигнала, связанные с неравномерным распределением репортера. Третий модуль (D_T) — направляющий, он меняется в зависимости от варианта Voltair и отвечает за локализацию репортера в плазматической мембране или мембране определенных органелл.

Так, Voltair^PM, нацеленный на плазматическую мембрану, D_T содержит молекулу, закрепляющую устройство на поверхности клетки таким образом, чтобы RVF оказывался в мембране. Вариант Voltair^IM, помечающий мембраны органелл, связывается с рецепторами-мусорщиками (scavenger receptors, SR) на поверхности клетки и попадает внутрь за счет SR-опосредованного эндоцитоза, попадая в ранние эндосомы и оставаясь в них в процессе созревания до поздних эндосом, а затем перемещаются в лизосомы. Ученые также получили варианты Voltair^RE и Voltair^TGN для изменения мембранного потенциала в эндосомах в процессе рециклинга и в транс-отделе комплекса Гольджи соответственно.

Работу Voltair^PM проверили на клетках HEK293T. При добавлении к культуре клеток зонд эффективно закреплялся на плазматической мембране клеток. С помощью метода фиксации напряжения в диапазоне от –100 мВ до +100 мВ с шагом 10 мВ ученые определили отношения флуоресцентных сигналов репортера RVF (канал G) и референса Atto647N (канал R). Примечательно, что интенсивность сигнала в канале G изменялась в зависимости от приложенного напряжения, в то время как сигнал в канале R был постоянным. Отношение G/R в дальнейшем использовалось для определения мембоанных потенциалов. Так, по величине G/R ученые установили, что мембранный потенциал покоящейся клетки составляет –50мВ, что согласуется с литературными данными.

Далее ученые использовали Voltair для измерения мембранного потенциала различных органоидов и оценки вклада электрогенной V-АТФазы — протонной помпы, работа которой может влиять на потенциал. Например, с помощью Voltair^RE они показали, что мембранный потенциал рециркулирующей эндосомы (VRE) составляет +65 мВ, при этом блокирование V-АТФазы не давало значимых изменений.

В другом эксперименте ученые с помощью Voltair^IM описали новую роль мембранного потенциала лизосомы в том, как клетка ощущает истощение запасов питательных веществ. На дефицит питательных веществ в клетке реагирует комплекс mTORC1. В норме mTORC1 присутствует в лизосомах, где он регулирует активность различных лизосомальных белков. При дефиците питательных веществ mTORC1 отделяется от лизосомы. Ученые показали, что при этом мембранный потенциал лизосомы снижается. Деполяризованная мембрана способствует запуску сигнальных путей, связанных с биогенезом лизосом и усилением регуляции аутофагии.

По словам авторов, измерение мембранного потенциала в органеллах, которое ранее казалось невозможным, дает возможность раскрыть зависимость функций органелл в живой клетке от этого показателя.