Доставка иммунотоксинов в раковую клетку по частям

В настоящее время известно множество методов лечения рака. Однако все они в той или иной степени оказывают негативное воздействие и на здоровые клетки. Ученые из университета Огайо предположили, что доставка иммунотоксинов к раковым клеткам в виде двух «половинок» с последующей сборкой внутри клетки может помочь снизить вредоносные эффекты раковой терапии. Для проверки этой концепции они провели исследование, результаты которого опубликовали в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

Иммунотоксины состоят из двух частей — собственно токсина и таргетной части (обычно на основе антител). Таргетная часть прикрепляется к рецептору в клеточной мембране и позволяет токсину попасть в клетку. Такой способ позволяет направить токсин именно в клетки опухоли, однако доставка происходит недостаточно специфично — затрагиваются также и здоровые клетки. Бактериальные токсины, на основе которых создаются противораковые препараты этого типа, — сильнодействующие вещества, поэтому даже умеренный уровень неспецифической доставки может привести к неприемлемым побочным эффектам.

Интеины — это ферменты, которые способны, будучи встроенными в структуру белка, самостоятельно индуцировать сплайсинг, то есть сшить ограничивающие их полипептидные последовательности (экстеины) вместе. Одно из важных свойств интеинов — они сохраняют свои функции, даже если разделены на два фрагмента — N-терминальный (In) и C-терминальный (Ic).

Идея раздельной доставки иммунотоксинов состоит в том, что молекула токсина делится на две инертные части и в таком виде вводится в организм. Доставка каждой из частей опосредуется специфическим клеточным рецептором, чрезмерно экспрессирующимся на поверхности раковых клеток. После того, как обе части оказались в клетке, функционально активный токсин реконструируется за счет интеин-опосредованного транссплайсинга.

Для модельного исследования использовали комплекс клеточного проникновения токсина сибирской язвы, сплит-интеин белка DnaE цианобактерии Nostoc punctiforme в качестве восстановителя структуры и каталитический домен дифтерийного токсина (DTA) в качестве агента, убивающего клетки.

Фрагмент токсина сибирской язвы, использованный в работе, включал в себя защитный антиген (PA), который распознает рецепторы и образует поры в мембране, и N-терминальный участок летального фактора (LFn). Методом генной инженерии N- и C-терминальные фрагменты DTA (DTAn и DTAc) сливались со сплит-интеином и LFn. Полученные конструкты — LFn-DTAn-In и LFn-Iс-DTAс — снабжали PA для доставки в клетки.

Ученые добились стабильного разделения и сборки активного токсина DTA. Из пяти протестированных точек разделения более эффективными оказались находящиеся ближе к концам токсина. При тестировании на клеточных культурах все фрагменты были инертными, в то время как восстановленные DTA показывали нормальную активность.

Для оценки пригодности сплит-интеинов к транспортировке их связывали с доменом, ковалентно модифицирующим актин (ACD), MARXT токсина Vibrio cholerae и LFn. Комплекс PA/LFn-ACD удобен для использования в качестве маркера, так как уже через один-два часа после его проникновения клетка изменяет форму, становясь шарообразной. Связывание Ic с комплексом незначительно повлияло на клеточную активность ACD, в то время как при связывании In наблюдалось значительное ее уменьшение.

Попытки доставить обе части DTA в клетки с помощью PA/LFn комплекса успехом не увенчались, вероятнее всего, из-за низкой концентрации доставляемых компонентов. Тогда ученые обратились к альтернативной стратегии: доставлять в клетку только одну часть токсина, а вторую экспрессировать внутри нее.

Были получены устойчивые клоны клеток человеческой остеосаркомы U2OS и 143.98.2, а также рака груди SK-BR-3, экспрессирующие N-концевой фрагмент DTAn-In. Обработка этих клонов соответствующим С-концевым фрагментом LFс-Iс-DTAс в комплексе с PA, который связывался с рецепторами клеток, приводила к проявлению активности DTA (ингибированию синтеза белка и клеточной смерти). Примечательно, что для этого оказалось достаточным добавление очень низких концентраций (от 10 до 100 pM) LFс-Iс-DTAс фрагмента.

Возможность использования разделенного DTA токсина на уровне организма была подтверждена на мышиной модели человеческой опухоли.

В настоящее время авторы изучают возможности специфической доставки фрагментов в раковые клетки на уровне кодирующей ДНК (например, через онколитические вирусы) и в виде белковых фрагментов через клеточные рецепторы, рассказал PCR.news руководитель исследования, заведующий лабораторией Дмитрий Кудряшов. Параллельно ведется работа над усовершенствованием фрагментов токсина и интеинов для их более эффективного взаимодействия в клетках.

«В перспективе эти исследования могут существенно уменьшить токсические побочные эффекты иммунотоксинов на организм пациентов, одновременно увеличивая специфичность воздействия на раковые опухоли», — добавила ведущий сотрудник лаборатории и соавтор публикации Елена Кудряшова.