Древние рибозимы могли самореплицироваться за счет триплетов

Согласно современным представлениям, зарождение матричного биосинтеза и наследственности началось с РНК. Открытие рибозимов — молекул РНК с каталитическими свойствами, описанных Сидни Олтменом и Томасом Чеком в 1980-х годах, — укрепило эту гипотезу. На данный момент главной сложностью моделирования саморепликации РНК является «проблема разделения цепей». Дело в том, что одноцепочечные РНК (оцРНК) сами по себе химически нестабильны и склонны к формированию устойчивых дуплексов, что препятствует репликации РНК. Исследовательский коллектив из Великобритании и США предложил решение этой проблемы — в качестве субстрата для репликации и стабилизатора оцРНК ученые использовали тринуклеотидтрифосфаты.

Сперва исследователи проанализировали условия диссоциации РНК-дуплексов. В присутствии ионов Mg²⁺, необходимых для работы полимеразного рибозима TRP (5TU/t1), использующего для элонгации РНК нуклеотидные триплеты, температура диссоциации двуцепочечной РНК (дцРНК) превышала 90℃. При этом разрушались оцРНК и сам TRP. Снижение pH среды до 2,5–3 приводило к диссоциации дуплексов, однако инактивировало TRP. Тогда ученые попробовали сперва закислить среду, затем нейтрализовать ее и только после этого добавлять TRP, праймеры и триплеты в качестве субстрата. Такая постановка повысила репликацию (+) и (–) цепей дцРНК до уровня 30–40% от выхода контрольной репликации с одноцепочечных РНК. Увеличение времени между денатурацией дуплексов и добавлением триплетов (в особенности GC-богатых) значительно снижало выход репликации, тогда как отсроченное добавление TRP на него не влияло. Авторы предположили, что триплеты связывают оцРНК и предотвращают их повторный отжиг.

Исследователи разработали полноценный цикл репликации РНК, объединив противоположные условия, необходимые для денатурации дуплексов и последующей репликации. Денатурация проводилась в подкисленной нагретой среде, после чего следовал этап замораживания в более щелочных условиях, который способствовал концентрированию реагентов и активации TRP. Такой режим циклического изменения pH и температуры позволил добиться эффективного разделения цепей и их копирования — уже ко второму циклу продукты предыдущего использовались в качестве матрицы.

Далее исследователи применили разработанный метод к библиотеке случайных РНК-матриц, добавляя в систему все возможные триплетные субстраты. В ходе 40 циклов определенные короткие последовательности начали доминировать — количество некоторых возросло в 60 000 раз, — что указывает на их способность к более эффективной репликации. В большом количестве таких триплетов встречался паттерн G/C, G/C, N.

Ученые продемонстрировали, что рибозим TRP способен частично самореплицироваться, воспроизводя фрагмент своей каталитической области (γ-сегмент) в условиях pH/температурных циклов. После двух циклов они зафиксировали появление продуктов репликации, которые в последующих циклах уже выступали в качестве матриц. Более того, даже в контроле без добавленной матрицы РНК наблюдалось образование γ-продуктов, предположительно за счет копирования γ-сегмента в самом TRP. Репликация усиливалась при частичном разложении рибозима, что указывает на использование его фрагментов в качестве матриц для репликации.

Исследователи протестировали возможность самопроизвольной репликации РНК без праймеров — как это могло бы происходить на пребиотическом этапе эволюции. В реакции использовались случайные 20-нуклеотидные РНК-матрицы и все возможные триплетные субстраты, но праймеры в смесь не добавлялись. Уже через пять циклов появился «лестничный» паттерн продуктов электрофореза, что свидетельствует о последовательном добавлении триплетов. Последующее секвенирование показало, что большая часть синтезированных РНК частично комплементарна рибозиму TPR, указывая, что он выступал одновременно как катализатор и как матрица. Кроме того, возникали и совершенно новые РНК-последовательности, не гомологичные TPR.

Данная работа показала, что рибозим TPR способен запускать и поддерживать репликацию РНК без праймеров, способствуя образованию и эволюции разнообразных последовательностей. Также ее авторы выяснили, что включение триплетов с трифосфатной группой решает «проблему разделения цепей» и делает саморепликацию РНК возможной. Это приближает нас к пониманию того, как возникли первые матричные синтезы в условиях древней Земли. «Изменяющиеся условия, которые мы спроектировали, могут возникать и естественным образом, например, при колебаниях температур за счет смены дня и ночи или в геотермальных средах, где горячие породы встречаются с холодной атмосферой», — подчеркивает ведущий автор работы доктор Джеймс Эттуотер.

Рибозим со свойствами РНК-полимеразы синтезировал функциональные молекулы РНК