Рибозим со свойствами РНК-полимеразы синтезировал функциональные молекулы РНК

Один из авторов работы — президент и директор по науке Института Солка Джеральд Джойс, который много лет занимается эволюцией in vitro, в том числе моделированием мира РНК. Согласно гипотезе мира РНК, на заре жизни за Земле молекулы РНК были как носителями наследственной информации, так и ферментами (рибозимами). В такой системе молекула РНК со свойствами РНК-полимеразы могла бы синтезировать сама себя и другие необходимые молекулы, либо молекулы одного типа синтезировали молекулы второго, которые, в свою очередь, синтезировали молекулы первого типа (см. работу Джойса с коллегой 2009 года; правда, в этой работе сборка осуществляется из введенных в систему фрагментов РНК, а не из нуклеозидтрифосфатов).

В лаборатории Джеральда Джойса были получены РНК-полимеразы класса I, синтезирующие функциональные РНК-аптамеры и рибозимы. Полимеразы происходили от РНК-лигазы класса I — рибозима, который получили в лаборатории Джека Шостака еще в 1995 году. В присутствии матрицы и праймера ферменты Джойса могли реплицировать РНК длиной более 100 нуклеотидов.

В работе 2020 года исследователи получили РНК-полимеразы класса I, способные синтезировать своего «предка» — РНК-лигазу класса I — в виде трех отдельных цепей, которые затем собирались в функциональный рибозим. (Далее будем называть их просто РНК-полимеразой и РНК-лигазой.) На этом примере можно понять, как работает эволюция РНК in vitro.

 Один из этапов эволюции РНК-полимеразы класса I —рибозима, производящего рибозимы. Credit: PNAS, 2020. DOI: 10.1073/pnas.1914282117

К РНК-полимеразе присоединяется РНК-шпилька, содержащая праймер (пурпурный), участок с молекулой  биотина (зеленый) и РНК-субстрат (оранжевый), который будет расщеплен продуктом полимеризации. На праймер отжигается матрица (коричневый) для синтеза участка РНК, превращающего шпильку с биотином в рибозим — молекулу РНК типа «головка молота» (hammerhead), которая разрезает сама себя. Полимераза синтезирует hammerhead (голубой) на матрице, и вся конструкция захватывается на магнитные шарики со стрептавидином. Если hammerhead успешно синтезирован (а в нем есть участок, крайне чувствительный к ошибкам), он вносит разрез в оранжевый участок, полимераза высвобождается, подвергается обратной транскрипции и ПЦР-амплификации; затем с помощью транскрипции синтезируются дочерние молекулы полимеразы, и цикл повторяется.

Десятки раундов эволюции в этой системе улучшили свойства РНК-полимеразы, существенно сократили время получение полноразмерного продукта. Однако точность синтеза РНК оставалась недостаточно высокой, и лишь незначительная доля молекул лигазы, которые они синтезировали, обладала каталитической активностью. Авторы отмечали, что понадобится более строгий отбор, чтобы получить РНК-полимеразы с высокой точностью, которые смогли бы синтезировать более длинные молекулы.

В новой работе Джойс и соавторы получили РНК-полимеразы, способные синтезировать целую молекулу РНК-лигазы с достаточно низким уровнем ошибок. Стратегия эволюции, которая использовалась в эксперименте, аналогична вышеописанной. В этот раз РНК-полимераза синтезировала на матрице РНК-лигазу, а затем подвергалась обратной транскрипции, причем оставалась связанной со своим продуктом. К полученной молекуле кДНК пришивалась РНК-шпилька с однонитевым разрывом и молекулой биотина. Если РНК-лигаза, которую синтезировал данный вариант РНК-полимеразы, была функциональна, то она сшивала разрыв, и вся конструкция могла быть выделена с помощью бусин со стрептавидином. (К сожалению, мы не можем показать эту иллюстрацию, так как статья закрытая.) 

В итоге удалось получить рибозимы, обладающие необходимой — беспрецедентно высокой, подчеркивают авторы — точностью. Лучше всего показал себя рибозим, отличающийся от ранее полученного варианта десятью точечными мутациями и обозначенный 71-89 (для его получения потребовался в общей сложности 71 раунд эволюции).

Затем авторы сравнили новую высокоточную РНК-полимеразу и РНК-полимеразу с низкой точностью по способности синтезировать hammerhead и проводить раунды его эволюции. Процесс был организован так же, как в эксперименте 2020 года: о качестве полимеризации говорила способность готовой РНК-структуры к саморасщеплению, соответственно, успешные молекулы hammerhead «проходили в следующий тур» и становились матрицами для синтеза новых копий.

Полимераза с низкой точностью могла поддерживать каталитические свойства субстрата лишь в течение нескольких поколений. Высокоточная полимераза не только справилась с этой задачей на протяжении восьми раундов, но и создала молекулы, превосходящие стартовый вариант по «приспособленности» (интересно, что они могли хуже разрезать сами себя, но лучше копировались полимеразой).

Таким образом, впервые рибозимы in vitro были использованы для репликации и эволюции других функциональных РНК. Гипотеза РНК-мира получила существенное подтверждение, кроме того, открылись возможности для новых подобных экспериментов.

Эксперимент по эволюции РНК, кодирующей РНК-репликазу: промежуточные итоги