Две CRISPR-нуклеазы детектируют РНК за 20 минут

Ученые под руководством нобелевского лауреата Дженнифер Дудны разработали новый метод на основе CRISPR-Cas-системы для быстрого выявления специфических РНК. Этот метод, получивший название FIND-IT (от Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem), позволяет выявить 30 молекул РНК-мишени в микролитре раствора за 20 минут без предварительной амплификации. В качестве одной из области применения метода авторы предлагают экспресс-диагностику инфекции SARS-CoV-2.

Обычные методы для выявления РНК в клинических образцах, основанные на количественной ПЦР с обратной транскрипции, хотя и очень чувствительны, но слишком сложны для экспресс-диагностики в месте оказания медицинской помощи. Разработчики FIND-IT предлагают выявлять РНК-мишени с помощью двух неродственных CRISPR-нуклеаз — Cas13 и Csm6.

Сначала Cas13 привлекается к РНК-мишени с помощью гидРНК. После распознавания мишени Cas13 вносит разрыв в активирующий олигонуклеотид, в результате чего высвобождается специфический фрагмент РНК. Этот фрагмент связывается с комплексом Csm6, который разрезает олигонуклеотиды, на одном из концов которых находится флуоресцентная метка, а на другом — гаситель сигнала. Последовательное действие Cas13 и Csm6 приводит к тому, что высвобождается флуоресцентная метка, которую можно детектировать.

Одношаговый вариант метода, не предполагающий предварительную амплификацию мишени, позволяет в течение 20 минут выявить РНК в образце, причем нижний предел детекции достигает 30 молекул РНК-мишени в микролитре раствора. Если РНК-мишень предварительно амплифицировать, то нижняя граница снижается до аттомолярных значений.

В качестве одного из применений FIND-IT авторы работы предлагают быструю детекцию РНК SARS-CoV-2 с помощью белка Cas13a бактерии Leptotrichia wadei, белка Csm6 из Enterococcus italicus, восьми гидовых РНК для Cas13a и химически стабильных олигонуклеотидов-активаторов для Csm6. Эту систему детекции SARS-CoV-2 можно поместить в микрофлюидный чип и за полчаса выявить РНК SARS-CoV-2 в клиническом образце.