Экспериментальная эволюция раскрывает механизмы резистентности бактерий к антибиотикам

Повсеместное применение антибиотиков, особенно в период пандемии и сезонных ОРВИ, способствует возникновению резистентных бактериальных штаммов. Исследования механизмов развития устойчивости очень важны как для ее минимизации, так и для контроля и корректировки лечения.

Ученые из японского Центра исследований динамики биосистем (BDR) института RIKEN разработали полностью автоматизированную систему культивирования для проведения высокопроизводительной лабораторной эволюции кишечной палочки под действием 95 стрессоров на протяжении более 250 поколений.

«Лабораторная эволюция в сочетании с геномным анализом — многообещающий подход к пониманию динамики устойчивости к антибиотикам, — объясняет руководитель исследования Томоя Маэда. — Однако лабораторная эволюция очень трудоемкая, поскольку требует последовательных пересевов культур в течение длительного периода и множества параллельных экспериментов». Кроме того, выявить гены устойчивости не всегда легко из-за большого количества генетических особенностей, содержащихся в данных.

Чтобы проанализировать сеть перекрестной резистентности и побочной чувствительности, на колонии бактерий воздействовали различными антибактериальными стрессорами с разными механизмами действия, как антибиотическими так и неантибиотическими (всего 95 веществ). Для каждого вещества культивировали по 6 колоний, и еще 6 контрольных. Из этих 576 колоний для дальнейшего геномного исследования взяли 192 штамма: по 4 от 47 стрессоров, и 4 — контроль. Выбранные колонии показывали наиболее высокие значения полумаксимальной ингибирующей концентрации действующего вещества, то есть, очевидно, содержали мутации устойчивости.

Для 192 колоний провели секвенирование генома, чтобы выявить изменения, возникшие в процессе эволюции под действием стрессора. Фенотипические изменения эволюционировавших штаммов количественно оценивали с помощью транскриптомного анализа (исследовали уровень экспрессии генов, предположительно отвечающих за устойчивость к стрессору). В результате были созданы профили устойчивости. Исследователи также разработали метод машинного обучения для анализа данных, позволяющий идентифицировать как новые, так и хорошо известные гены.

Чтобы проверить, действительно ли полученные одиночные мутации способствуют резистентности, исследователи вводили такие мутации в родительский геном. Попарные коэффициенты корреляции между стрессами, указывающие на перекрестную резистентность и коллатеральную чувствительность, которые наблюдались у реконструированных мутантов, согласуются с таковыми у эволюционировавших штаммов. Это позволяет предположить, что устойчивость связана с мутациями. Однако между эволюционировавшими и родительскими штаммами были и различия, которые могут говорить о влиянии множественных мутаций и эпистаза в изменения устойчивости. Помимо генетических факторов могли быть и другие механизмы адаптации, которые невозможно было учесть в данном исследовании, отмечают авторы.

Кроме того, из 2162 пар комбинаций действующих веществ обнаружились 365 пар, к которым E. coli демонстрировала перекрестную резистентность, и 157 пар с побочной чувствительностью. Проанализировав последние, авторы предположили, что нарушение метаболической активности, генерация активных форм кислорода и изменение проницаемости клеточной мембраны могут служить возможными стратегиями подавления устойчивости к антибиотикам.