Фармакологический шаперон восстановил работу 87% патогенных вариантов рецептора вазопрессина

Для лечения генетических патологий не обязательно индивидуализировать терапию под каждую мутацию — до 60% патогенных вариантов, вызывающих редкие заболевания, приводят именно к сокращению уровня функционального белка, то есть к снижению его стабильности или количества. Для таких случаев идеальным инструментом могут стать фармакологические шапероны — малые молекулы, которые связываются с целевым белком в его нативном, правильно свернутом состоянии, повышая его термостабильность и способствуя доставке к целевой локализации в клетке.

Фармакологические шапероны, такие как, например, комбинация препаратов для лечения муковисцидоза, уже успешно применяются в клинике. Однако до сих пор оставалось неясным, насколько универсальным может быть эффект одного фармакологического шаперона. Предыдущие исследования, как правило, тестировали эффективность стабилизаторов лишь на ограниченном наборе вариантов, что порождало сомнения в их широкой применимости.
Ученые из Испании решили проверить, может ли одна малая молекула обеспечить стабилизацию, слабо зависящую от места мутации в белке, если эта молекула связывается с белком в свернутом состоянии.

В качестве модельной системы авторы выбрали рецептор вазопрессина 2 (V2R), который относится к рецепторам, сопряженным с G-белком (GPCR). Потеря функции V2R — ключевого регулятора водного гомеостаза в почках — приводит к развитию нефрогенного несахарного диабета (NDI). Известно, что сотни вариантов в гене AVPR2, кодирующем рецептор вазопрессина 2, связаны с NDI, и примерно половина из них являются миссенс-вариантами.
Для всесторонней оценки влияния мутаций на V2R исследователи применили комплексный подход, включающий высокопроизводительное глубокое мутационное сканирование (deep mutational scanning).

Сначала авторы получили обширную библиотеку вариантов V2R, содержащую все возможные замены одной аминокислоты в кодирующей последовательности (около 7 тысяч миссенс- и нонсенс-вариантов). Эту библиотеку они экспрессировали в клетках HEK293T. С помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и иммуноокрашивания, нацеленного на метку НА, находящуюся на внеклеточном конце рецептора, ученые количественно измерили, насколько эффективно каждый из мутантных вариантов достигает клеточной поверхности.

Полученные результаты показали, что нарушенная поверхностная экспрессия — основной фактор патогенности V2R. Более половины (55,6%) известных клинических вариантов NDI являются «плохо экспрессируемыми».

Для подтверждения того, что дефект рецептора V2R, связанный с нефрогенным несахарным диабетом (NDI), вызван именно потерей термодинамической стабильности, исследователи культивировали клетки при пониженной температуре (27 °C). Известно, что снижение температуры может способствовать более эффективному сворачиванию белков. В данном случае оно привело к сдвигу в распределении поверхностной экспрессии, при этом наибольшее восстановление наблюдалось у вариантов с умеренным (средним) уровнем экспрессии.

Тот факт, что большинство вариантов удалось привести к норме, подтвердил гипотезу, согласно которой потеря термодинамической стабильности — основной патогенный механизм, обусловливающий нарушения поверхностной экспрессии.

Основываясь на широкой эффективности температурного восстановления фенотипа, исследователи перешли к тестированию фармакологического шаперона — толваптана. Толваптан (Tolvaptan, также известный как OPC-41061) — это антагонист V2R, уже одобренный для клинического применения при аутосомно-доминантном поликистозе почек.

Толваптан восстанавливал экспрессию функционального рецептора эффективнее, чем снижение температуры, с большим количеством клеток, переходящих от низкой к высокой экспрессии. Препарат показал поразительную эффективность в спасении патогенных аллелей NDI, 87,0% плохо экспрессируемых вариантов были спасены до умеренного или высокого уровня экспрессии. 

Небольшое число вариантов, фенотип при которых не восстанавливался толваптаном, дали важную информацию о механизме действия препарата и функциональных участках рецептора. Эти «неспасенные» мутации группировались в трех основных категориях. Первую составляли мутации аминокислотных остатков, образующих предполагаемое место связывания толваптана. Фенотип в таких случаях восстанавливался хуже, чем ожидалось, поскольку эти замены могут препятствовать связыванию самой молекулы-стабилизатора. Также толваптан не смог компенсировать дефекты в сайтах гликозилирования (S5, T6, N22 и S24) — это указывает на то, что эти варианты вызывают патологию не только из-за потери стабильности, но и из-за специфичного нарушения биосинтеза. Наконец, толваптан слабо действовал в случае вариантов, расположенных вблизи консервативного мотива E/DRY (например, R1373x50). Этот мотив важен для стабилизации неактивного состояния GPCR.

Это исследование охватило на порядок больше вариантов, чем предыдущие работы, и предоставило фундаментальное доказательство концепции. Толваптан, как одиночный фармакологический шаперон, восстанавливал работу почти всех дестабилизированных вариантов рецептора V2R (87%), что подтверждает модель аддитивности свободных энергий. Согласно этой модели, любая малая молекула, которая достаточно прочно связывается с правильно свернутым состоянием белка, может компенсировать небольшие изменения свободной энергии, вызванные большинством мутаций, независимо от их расположения в структуре белка. Это возможно потому, что большинство белков обладают пограничной стабильностью, а энергия связывания фармакологического шаперона (достигающая 12 ккал/моль в случае толваптана) достаточна для того, чтобы сместить равновесие сворачивания в сторону функциональной формы.

Основанный на полученных данных подход позволяет разрабатывать широко действующие стабилизаторы (или универсальные фармакологические шапероны) для лечения редких заболеваний, вызванных миссенс-вариантами, устраняя необходимость создания индивидуального препарата для каждой редкой мутации. Хотя необходимы дополнительные исследования, чтобы подтвердить сигнальную активность восстановленных рецепторов, полученные результаты имеют широкие последствия для терапии редких болезней.

Ингибитор активной формы мутантного KRAS эффективен против рака легких у мышей