Флуоресцентная метка Hoechst-Cy5 помогает изучать структуру хроматина

Визуализация архитектуры ядра имеет огромное значение в диагностике и исследовании онкологических заболеваний. Один из самых простых методов в этой области — флуоресцентная микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM). Однако эта технология страдает от отсутствия подходящей флуоресцентной метки для ДНК — существующие красители либо не имеют специфичности к ДНК, либо не обладают оптимальными характеристиками для STORM. Команда ученых из США разработала новую флуоресцентную метку, которая позволяет визуализировать ДНК с помощью STORM.

Метка представляет собой конъюгат ДНК-специфичного красителя Hoechst с Cy5 — эталонной для STORM флуоресцентной молекулой. Конъюгат валидировали на образцах кишечной ткани мышей. Образцы были подготовлены стандартным образом — зафиксированы в формалине и заключены в парафин. Изображения, полученные с помощью STORM, обрабатывались специальным алгоритмом. Новая метка давала наилучшее отношение сигнал/шум по сравнению с другими красителями и позволяла детектировать нанодомены хроматина с более высоким разрешением. Более того, с помощью Hoechst-Cy5 можно было анализировать функциональную архитектуру хроматина: конденсированные участки ассоциировались с эпигенетической меткой неактивного хроматина (H3K9me3), а открытые области пересекались с эпигенетической меткой активного хроматина (H3K4me3).

На следующем этапе Hoechst-Cy5 применили к образцам нормальной, предраковой и злокачественной ткани человеческой толстой кишки. Они обнаружили, что размеры конденсированных хроматиновых кластеров уменьшаются при канцерогенезе. По мнению ученых, это связано с уничтожением метки неактивного хроматина H3K9me3. С этим процессом ассоциировался рост концентрации РНК-полимераз, что может говорить об активной транскрипции генов.

При развитии рака взаимодействие хроматина с ядерной ламиной становится более значимым. Ученые обнаружили, что ядерная ламина фрагментируется. Размер кластера ламины положительно коррелирует с размерами доменов в периферическом хроматина. Распределение кластеров ламины по мере трансформации становится все более похожим на распределение кластеров хроматина.

Новая метка позволяет оценить риск развития опухоли. Чтобы это доказать, исследователи проанализировали срезы образцов толстой кишки от пациентов из группы высокого риска (в том числе, у пациентов с синдромом Линча). У пациентов с синдромом Линча с развившейся опухолью хроматиновые домены имели меньший размер, чем у пациентов без опухоли. Самые большие кластеры хроматина наблюдались у здоровых пациентов.

Таким образом, новая флуоресцентная метка позволяет изучать ультраструктуру хроматина и ее биологическое значение при различных заболеваниях.