Графеновые CRISPR-чипы — новый инструмент молекулярной диагностики

Графен — двумерный слой атомов углерода, объединенных в гексагональную решетку — обладает многими замечательными свойствами: он примерно в сто раз прочнее стали, хорошо проводит тепло и электричество, почти прозрачен, а кроме того, биосовместим. Его рассматривают как перспективный материал для изготовления транзисторов, работающих в биосистемах и преобразующих молекулярные сигналы в электрические

Преимущество этого подхода, сказал генеральный директор Cardea Майкл Хельцен , заключается в том, что он позволяет напрямую наблюдать ДНК, вместо того, чтобы выделять ДНК, разрушать, амплифицировать, метить, направлять на нее оптический лазер, чтобы обнаружить метку. Графеновые чипы исследуют ДНК в ее естественном состоянии и немедленно сигнализируют о наличии конкретной мутации, белка или другого компонента. Как отмечает Хельцен, современные методы анализа так или иначе изменяют биосистему, чтобы было удобно наблюдать тот или иной параметр — но не все параметры сразу, поэтому невозможно исследовать геном, протеом и транскриптом в одном и том же образце. Чтобы решить эту проблему, нужен новый подход.

Cardea начала свое существование, когда ее главный технический директор Бретт Голдсмит, эксперт по графену, решил поместить на поверхность графеновых транзисторов антигены, чтобы обнаруживать антитела в образце. Связывание антитела и антигена формирует небольшой заряд, который проходит через графен и преобразуется в положительный сигнал. По словам Хельтцена, на оптимизацию ушло около пяти лет. Они хотели выявлять и нуклеиновые кислоты, но это оказалось сложнее.

Киана Аран, ведущий исследователь в Кековском Институте прикладных наук о жизни, начала работать над созданием графеновых биотранзисторов в 2011–2012 году. Графен оказался чрезвычайно чувствительным, и его было проще, чем кремний, функционализировать, присоединяя к нему биомолекулы. У нее возникла идея присоединить к графеновому транзистору комплекс CRISPR-Cas, самое замечательное свойство которого — поиск определенных фрагментов нуклеиновых кислот. Аран использовала деактивированную нуклеазу Cas9 (dCas9), которая находит нужный участок ДНК, но не делает в нем разреза. Транзистор Аран на основе CRISPR, так же, как антигенный транзистор, ищет определенную биомолекулу, и когда находит, взаимодействие с ней создает заряд, который воспринимается графеном.

Однако изготовление графеновых чипов под задачи Кианы Аран отнимало массу времени. Эту проблему помогла решить коллаборация с Cardea, которая к этому моменту не только разработала процесс массового производства графеновых чипов, но и создала устройство для считывания сигнала. Арун и Хельцен стали соучредителями Nanosens, а Cardea предоставила лицензию на свои графеновые транзисторы новой компании.

В марте в журнале Nature Biomedical Engineering Аран и ее коллеги рассказали об использовании CRISPR-чипов для диагностики заболеваний. Они анализировали образцы ДНК из клеточных линий HEK293T, экспрессирующих синий флуоресцентный белок, а также изклинических образцов ДНК с двумя различными мутациями — делециями экзонов 3 и 51 в гене дистрофина человека, которые обычно обнаруживаются при миодистрофии Дюшенна. В течение 15 минут CRISPR-Chip сигнализировал о присутствии генов-мишеней в концентрации 1,7 фМ и без амплификации.

В июньском Nature Biomedical Engineering исследователи из Фрайбургского университета и Имперского колледжа Лондона отметили, что это устройство могло бы обнаруживать различные молекулы нуклеиновых кислот в одном образце, используя комплексы dCas9 с различными гидовыми РНК, хотя это увеличит стоимость и сложность. Хельцен и Аран отмечают, что компании уже работают над этой задачей и стараются найти самые элегантные и эффективные способы создания мультиплексных микросхем, будь то увеличение числа ферментов Cas на чипе, включение более чем одной рРНК в каждый CRISPR-комплекс или объединение нескольких чипов. Рассматривается также использование других нуклеаз, кроме dCas9, в том числе тех, что распознают РНК, а не ДНК. Некоторые аналиты труднее, чем другие, обнаружить без амплификации, поэтому компания работает над способами усиления сигналов ДНК непосредственно на чипе.

В итоге компании хотели бы создать устройство для диагностики у постели больного для медицинских учреждений. Планируется также сотрудничество с другими организациями и компаниями и производство CRISPR-графеновых чипов для их нужд. Хельцен сказал, что им бы хотелось видеть маленькую блестящую наклейку с надписью «Powered by Cardea» на различных диагностических устройствах, такую же, как Intel Inside на компьютерах и гаджетах. Компания также работает над созданием комплекта для подготовки образцов, который может продаваться вместе с чипом.

CRISPR-чипы можно использовать не только для диагностики, но и для исследовательских целей, для тестирования других технологий на основе CRISPR, оптимизации гидРНК. Что касается немедицинских прикладных применений, один из партнеров Cardea уже предложил компании разработать портативные транзисторы для диагностики болезней растений, чтобы сократить использование пестицидов.